C - Chemistry – Metallurgy – 07 – K
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
07
K
C07K 19/00 (2006.01) C12N 9/00 (2006.01) C12N 9/10 (2006.01) C12N 15/62 (2006.01) C12P 21/02 (2006.01) C12P 21/04 (2006.01)
Patent
CA 2344764
An in vitro method for producing a semi-synthetic fusion protein is provided, whereby a target protein fused to an intein - a protein splicing element - is selectively cleaved in a first step as depicted in Figure 1 with a thiol reagent, forming a carboxyl-terminal thioester of the target protein and releasing the target protein from the intein. In a subsequent step as shown in Figure 1, a desired, synthetic, protein or peptide having an amino-terminal cysteine is ligated to the target protein. Standard thiol-reagents such as DTT, or thiol-reagents optimized for ligation such as the odorless MESNA, may be used in the first step. The method permits the direct ligation of a desired peptide to a thioester bond that had linked a target protein to an intein. An in vivo variation of the method will permit production of a cytotoxic protein: a truncated, inactive, form of the protein fused to an intein is introduced in vivo, this fusion product is then selectively cleaved, and a synthetic protein or peptide is subsequently ligated at a carboxyl-terminal thioester of the target protein in order to restore the native activity of the cytotoxic protein.
Cette invention a trait à un procédé de production in vitro de protéine hybride semi-synthétique, lequel procédé consiste à produire une protéine cible fusionnée à un élémentrotéique d'épissage (une intéine), à cliver de manière sélective la protéine hybride et à ligaturer une protéine ou un peptide synthétique au thioester C-terminal de la protéine cible, ce qui permet de surmonter bon nombre des désavantages et des problèmes évoqués dans le descriptif. Cette invention fait notamment montre de meilleurs rendements et ce, en raison de la supériorité du clivage, induit par un thiol, par des réactifs thiol ayant été optimisés aux fins de la réaction de ligation. La ligation hors colonne autorise une concentration de l'échantillon et permet d'utiliser moins de peptides. MESNA est un réactif thiol inodore de ligation et l'intéine Mxe provient d'une source bactérienne; son expression est souvent meilleure dans des cellules bactériennes. Le procédé selon l'invention permet, de surcroît, de ligaturer directement les peptides à la liaison thioester formée entre une intéine et la protéine cible. L'invention porte, en outre, sur un procédé de production de protéine cytotoxique consistant à produire in vivo une forme inactive, tronquée, de la protéine, que l'on fait fusionner avec l'élément protéique d'épissage, à cliver, de manière sélective, la protéine hybride et à ligaturer une protéine ou un peptide synthétique au thioester C-terminal de la protéine cible afin de rétablir l'activité de la protéine cytotoxique naturelle. Elle concerne également des vecteurs de recombinaison servant à produire ces protéines hybrides pouvant être clivées.
Evans Thomas C.
Xu Ming-Qun
New England Biolabs Inc.
Ridout & Maybee Llp
LandOfFree
Intein mediated peptide ligation does not yet have a rating. At this time, there are no reviews or comments for this patent.
If you have personal experience with Intein mediated peptide ligation, we encourage you to share that experience with our LandOfFree.com community. Your opinion is very important and Intein mediated peptide ligation will most certainly appreciate the feedback.
Profile ID: LFCA-PAI-O-1559956