Isolation of binding proteins with high affinity to ligands

Details Isolation of binding proteins with high affinity to ligands Isolation of binding proteins with high affinity to ligands

C - Chemistry, Metallurgy

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Q

C12Q 1/04 (2006.01) C12N 1/20 (2006.01) C12Q 1/02 (2006.01) C12Q 1/34 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C40B 30/08 (2006.01) C40B 50/06 (2006.01) C12Q 1/25 (2006.01)

Patent

CA 2645194

The invention overcomes the deficiencies of the prior art by providing a rapid approach for isolating binding proteins capable of binding small molecules and peptides via "display-less" library screening. In the technique, libraries of candidate binding proteins, such as antibody sequences, are expressed in soluble form in the periplasmic space of gram negative bacteria, such as Escherichia coli, and are mixed with a labeled ligand. In clones expressing recombinant polypeptides with affinity for the ligand, the concentration of the labeled ligand bound to the binding protein is increased and allows the cells to be isolated from the rest of the library. Where fluorescent labeling of the target ligand is used, cells may be isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The approach is more rapid than prior art methods and avoids problems associated with the surface-expression of ligand fusion proteins employed with phage display.

L'invention surmonte les lacunes de l'art antérieur en fournissant une approche rapide pour l'isolement de protéines de liaison capables de se lier à des molécules et à des peptides de faible taille par le criblage de banques « sans méthode d'expression ». Selon la technique, des banques de protéines de liaison candidates, telles que des séquences d'anticorps, sont exprimées sous forme soluble dans l'espace périplasmique de bactéries à Gram négatif, telles qu'Escherichia coli, puis mélangées avec un ligand marqué. Dans des clones exprimant des polypeptides recombinants ayant une affinité pour le ligand, la concentration du ligand marqué lié à la protéine de liaison est accrue, permettant aux cellules d'être isolées du reste de la banque. Dans les cas où le marquage fluorescent du ligand cible est utilisé, les cellules peuvent être isolées par tri de cellules par fluorescence (FACS). La présente approche est plus rapide que celles de l'art antérieur et évite les problèmes liés à l'expression à la surface des protéines de fusion de ligands utilisées avec la méthode d'expression phagique.

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