C - Chemistry – Metallurgy – 07 – K
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
07
K
C07K 5/08 (2006.01) G01N 33/573 (2006.01)
Patent
CA 2269637
Disclosed are new ligands for use in a binding assay for proteases and phosphatases, which contain cysteine in their binding sites or as a necessary structural component for enzymatic binding. The sulfhydryl group of cysteine is the nucleophilic group in the enzyme's mechanistic proteolytic and hydrolytic properties. The assay can be used to determine the ability of new, unknown ligands and mixtures of compounds to competitively bind with the enzyme versus a known binding agent for the enzyme, e.g., a known enzyme inhibitor. By the use of a mutant form of the natural or native wild-type enzyme, in which serine, or another amino acid, e.g., alanine, replaces cysteine, the problem of interference from extraneous oxidizing and alkylating agents in the assay procedure is overcome. The interference arises because of oxidation or alkylation of the sulfhydryl, -SH (or -S-), in the cysteine, which then adversely affects the binding ability of the enzyme. Specifically disclosed is an assay for tyrosine phosphatases and cysteine proteases, including capsases and cathepsins, e.g., Cathepsin K(O2), utilizing scintillation proximity assay (SPA) technology. The assay has important applications in the discovery of compounds for the treatment and study of, for example, diabetes, immunosuppression, cancer, Alzheimer's disease and osteoporosis. The novel feature of the use of a mutant enzyme can be extended to its use in a wide variety of conventional colorimetric, photometric, spectrophotometric, radioimmunoassay and ligand-binding competitive assays.
L'invention concerne de nouveaux ligands utilisés dans un dosage pour liaison de protéases et de phosphatases, qui contiennent de la cystéine à leurs sites de fixation, ou en tant que composant structural nécessaire à une liaison enzymatique. Le groupe sulfhydryle de la cystéine constitue le groupe nucléophile dans les propriétés protéolytiques et hydrolytiques du mécanisme de l'enzyme. Ce dosage peut être utilisé pour déterminer la capacité de nouveaux ligands et mélanges inconnus de composants à se lier de façon compétitive à une enzyme, en comparaison avec un agent liant connu de l'enzyme, par ex. un inhibiteur connu de l'enzyme. L'utilisation d'une forme mutante de l'enzyme naturelle ou native de type sauvage, dans laquelle la sérine, ou un autre acide aminé, par ex. l'alanine, remplace la cystéine, permet de surmonter le problème d'une interférence causée par des agents étrangers oxydants et alkylants dans la procédure de dosage. Cette interférence apparaît à cause de l'oxydation ou de l'alkylation du sulfhydryle, -SH (ou-S?-¿), dans la cystéine, qui affecte ensuite de manière défavorable la capacité de liaison de l'enzyme. L'invention concerne spécifiquement un dosage destiné à des tyrosine phosphatases et des cystéine protéases, y compris des capsases et des cathepsines, par ex. la cathepsine K(O2), ledit dosage étant réalisé par une technique de dosage de proximité à scintillation. Ce dosage a des applications importantes dans la découverte de composés destinés au traitement et à l'étude, par exemple, du diabète, de l'immunodépression, du cancer, de la maladie d'Alzheimer et de l'ostéoporose. La nouvelle caractéristique que présente l'utilisation d'une enzyme mutante peut être étendue à son utilisation dans une large gamme de dosages classiques, tels des dosages par colorimétrie, photométrie ou spectrophotométrie, des radio-immuno et des dosages par liaison compétitive à des ligands.
Desmarais Sylvie
Friesen Richard
Zamboni Robert
Merck Frosst Canada & Co.
Merck Frosst Canada & Co./merck Frosst Canada & Cie
Ogilvy Renault Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
LandOfFree
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