C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12Q 1/00 (2006.01) C12Q 1/70 (2006.01)
Patent
CA 2331260
An assay and kit for the detection of phenotypic resistance of a retrovirus to a reverse transcriptase inhibitor drug in a biological sample. The assay is based on the direct analysis of the susceptibility of retroviral reverse transcriptase to inhibition by a reverse transcriptase inhibitor drug. The enzymatic activity of the reverse transcriptase is determined by measuring the DNA product produced when an RNA template and a first complementary DNA primer from a suitable region of the encephalomyocarditis virus genome are incubated with a biological sample containing reverse transcriptase in the presence of the drug to which resistance is being determined. The incubation mixture is reacted under conditions whereby the RNA template and the DNA primer will anneal and a DNA strand will be synthesized as an extension from the DNA primer if the reverse transcriptase in the sample is resistant to and not inhibited by the drug. The DNA product is amplified using a second complementary DNA primer from the encephalomyocarditis virus genome and suitable PCR reagents and conditions, and the amplified product detected in accordance with methods known to those skilled in the art. Detection of the amplified DNA indicates resistance to the drug employed in the assay.
La présente invention concerne un essai et un nécessaire de détection de la résistance phénotypique d'un rétrovirus prélevé dans un échantillon biologique à un médicament inhibiteur de transcriptase inverse. Cet essai repose sur une analyse directe de la susceptibilité d'une transcriptase inverse rétrovirale à l'inhibition par un médicament inhibiteur de transcriptase inverse. L'activité enzymatique de la transcriptase inverse se calcule en mesurant le produit d'ADN obtenu lorsqu'on met à incuber une matrice d'ARN et une première amorce d'ADN complémentaire en provenance d'une région appropriée du génome du virus de l'encéphalomyocardite, l'incubation se faisant avec un échantillon biologique contenant une transcriptase inverse, et ce, en présence du médicament par rapport auquel on cherche à déterminer la résistance. Le mélange d'incubation est mis à réagir dans des conditions telles que la matrice d'ARN et l'amorce d'ADN donneront lieu à une renaturation d'acide nucléique et où le brin d'ADN se synthétisera sous forme d'une extension prenant sur l'amorce d'ADN si la transcriptase inverse de l'échantillon est résistante au médicament et n'est pas inhibée par le médicament. L'amplification du produit d'ADN se fait en utilisant, d'une part une seconde amorce d'ADN complémentaire provenant du génome du virus de l'encéphalomyocardite, et d'autre part des réactifs appropriés d'amplification en chaîne par polymérase, dans les conditions adéquates. La détection du produit amplifié se fait selon les procédés habituels bien connus des praticiens. La détection d'ADN amplifié constitue une indication de la résistance au médicament employé dans l'essai.
Folks Thomas M.
Heneine Walid M.
Lerma Gerardo Garcia
Switzer William M.
Yamamoto Shinji
Gowling Lafleur Henderson Llp
The Government Of The United States Of America As Represented By
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-2014245