C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/861 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 7/01 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C12N 15/64 (2006.01)
Patent
CA 2424323
Applicants have identified a process which exploits the bacterial homologous recombination system to convert double-stranded linear adenovirus genome into circularized plasmid form (See Figure 4). The system functions via adenoviral terminal fragments present on the plasmid that are less than 500 basepairs each. The result is a plasmid which is more readily analyzed by restriction digestion, PCR, DNA sequencing or used in transient transfection studies. The adenovirus plasmids that are generated can be rescued back into virus form. The entire procedure takes 4 days or less instead of the weeks required of plaque purification or dilution cloning isolation techniques. An additional plus of the instant invention is that the disclosed method does not require the use of tissue culture materials or facilities. The disclosed method allows for a more extensive and thorough examination of a viral preparation, in that it allows for the detection of variants incapable of propagation without the assistance of co-infecting intact adenoviral genomes. Under standard conditions of plaque purification, these variant genomes are not detected. It is predicted that far more variant genomes will be observed using the rapid method than would otherwise be detected by standard plaque purification methods.
Les inventeurs ont identifié un procédé qui exploite le système de recombinaison homologue bactérienne pour convertir un génome adénoviral bicaténaire linéaire en une forme de plasmide circularisée (cf. Figure). Le système fonctionne au moyen de fragments terminaux adénoviraux présents sur le plasmide, fragments qui comportent moins de 500 paires de bases chacun. Il en résulte un plasmide qui est plus facilement analysable par digestion par restriction, par PCR, par séquençage ADN ou qui est utilisable dans des études de transfection transitoire. Les plasmides adénoviraux qui sont créés peuvent être sauvés à nouveau sous forme de virus. La procédure entière nécessite quatre jours ou moins, au lieu de plusieurs semaines que nécessitent des techniques d'isolement de clonage par formation ou dilution de plaques. Un avantage supplémentaire de la présente invention réside dans le fait que le procédé décrit ne nécessite pas l'utilisation de matériels ou installations de culture de tissu. Le procédé selon l'invention permet un examen plus complet et plus approfondi d'une préparation virale, étant donné qu'il permet de détecter des variants incapables de se propager sans l'aide de génomes adénoviraux co-infectieux intacts. Dans des conditions normales de purification de plaque, ces génomes variants ne sont pas détectés. Il est prévu qu'un nombre bien supérieur de génomes variants soient observés au moyen de ce procédé rapide que le nombre de génomes variants qui seraient autrement détectés par des procédés usuels de purification de plaque.
Youil Rima
Gowling Lafleur Henderson Llp
Merck & Co. Inc.
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1787237