C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) B01L 7/00 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) C12Q 1/70 (2006.01) G01N 35/00 (2006.01)
Patent
CA 2253278
Sequencing reactions are performed directly on complex DNA mixtures, such as the products of multiplex amplification reactions, which could not previously be used for sequencing without intermediate amplification and/or purification to increase the amount of target DNA present relative to other DNA species. The positions of at least one base within a selected region of a target nucleic acid polymer in a complex mixture of DNA are determined by combining the mixture with a reaction mixture comprising all four types of deoxynucleotide triphosphates, one type of dideoxynucleotide triphosphate corresponding to the base to be determined, first and second primers and a thermally stable polymerase enzyme which incorporates dideoxynucleotides into an extending nucleic acid polymer at a rate which is no less than about 0.4 times the rate of incorporation of deoxynucleotides in an amplification mixture for a plurality of amplification cycles to form a reaction mixture, said first and second primers binding to the sense and antisense strands, respectively, of the target nucleic acid polymer for amplification of the selected region; exposing the reaction mixture to a plurality of temperature cycles each of which includes at least a high temperature denaturation phase and a lower temperature extension phase to produce a product mixture comprising sequencing fragments which are terminated by incorporation of the dideoxynucleotide; and evaluating product mixture to determine the lengths of the sequencing fragments produced. This method can be used as part of a diagnostic method for analyzing a plurality of regions within a nucleic acid- containing sample for the presence of mutations by first performing a multiplex amplification reaction on the nucleic acid-containing sample using a plurality of primer pairs, one pair for each of the plurality of regions to be analyzed to produce a mixture of amplified fragments. The fragments are analyzed in accordance with the experimental protocol being employed, for example by a fragment length analysis. Thereafter, sequencing determinations are made by combining at least one aliquot of the mixture of amplified fragments with a sequencing mixture.
Des réactions de séquençage sont réalisées directement sur des mélanges d'ADN complexes tels que les produits de réactions d'amplification multiplex, mélanges qui ne pouvaient être auparavant utilisés pour le séquençage, sans amplification et/ou purification intermédiaire afin d'augmenter la quantité d'ADN cible présent par rapport à d'autres espèces d'ADN. On détermine les positions d'au moins une base dans une région sélectionnée d'un polymère d'acide nucléique cible d'un mélange complexe d'ADN en combinant le mélange avec un mélange réactionnel comprenant les quatre types de désoxynucléotides triphosphates, un type de didésoxynucléotide triphosphate correspondant à la base à déterminer, des première et seconde amorces et une enzyme polymérase thermostable qui contient lesdits désoxynucléotides dans un polymère d'extension d'acide nucléique, à une vitesse qui n'est pas inférieure à environ 0,4 fois la vitesse d'incorporation des désoxynucléotides dans un mélange d'amplification d'une pluralité de cycles d'amplification afin d'obtenir un mélange réactionnel. Les première et seconde amorces se fixent, respectivement, aux brins sens et antisens du polymère cible d'acide nucléique pour l'amplification de la région sélectionnée; puis on expose le mélange réactionnel à une pluralité de cycles de températures, chacun d'eux comprenant au moins une phase de dénaturation haute température et une phase d'extension basse température, afin d'obtenir un mélange de produits comprenant des fragments de séquençage qui sont terminés par l'incorporation du didésoxynucléotide; et on évalue le mélange de produits obtenu pour déterminer les longueurs de fragments de séquençage produites. Ce procédé peut être utilisé en partie comme méthode diagnostique afin d'analyser une pluralité de régions dans un échantillon contenant un acide nucléique, et de rechercher la présence de mutations, ce procédé consistant d'abord à réaliser une réaction par amplification multiplex sur l'échantillon contenant l'acide nucléique, au moyen d'une pluralité de paires d'amorces, une paire étant prévue pour chacune des régions de la pluralité de régions à analyser, afin d'obtenir un mélange de fragments amplifiés. Les fragments sont analysés conformément au protocole expérimental utilisé, et sont soumis, par exemple, à une analyse de longueur de fragment. On procède ensuite aux déterminations de séquençage en combinant au moins un aliquot du mélange de fragments amplifiés avec un mélange de séquençage.
Dunn James M.
Hui May
Lacroix Jean-Michel
Larson Marina T.
Leushner James
Bayer Healthcare Llc
Torys Llp
Visible Genetics Inc.
LandOfFree
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