C - Chemistry – Metallurgy – 07 – H
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
07
H
C07H 21/04 (2006.01) C07K 14/47 (2006.01) C12N 5/16 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/70 (2006.01) C12N 15/79 (2006.01) C12N 15/85 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2272823
The invention features a method for identifying a cDNA nucleic acid encoding a mammalian protein having a signal sequence, which method includes the following steps: a) providing library of mammalian cDNA; b) ligating the library of mammalian cDNA to DNA encoding alkaline phosphatase lacking both a signal sequence and a membrane anchor sequence to form ligated DNA; c) transforming bacterial cells with the ligated DNA to create a bacterial cell clone library; d) isolating DNA comprising the mammalian cDNA from at least one clone in the bacterial cell clone library; e) separately transfecting DNA isolated from clones in step (d) into mammalian cells which do not express alkaline phosphatase to create a mammalian cell clone library wherein each clone in the mammalian cell clone library corresponds to a clone in the bacterial cell clone library; f) identifying a clone in the mammalian cell clone library which express alkaline phosphatase; g) identifying the clone in the bacterial cell clone library corresponding to the clone in the mammalian cell clone library identified in step (f); and h) isolating and sequencing a portion of the mammalian cDNA present in the bacterial cell library clone identified in step (g) to identify a mammalian cDNA encoding a mammalian protein having a signal sequence.
Cette invention se rapporte à un procédé permettant d'identifier un acide nucléique d'ADNc codant une protéine mammalienne ayant une séquence signal, ce procédé consistant en: a) à prendre une banque d'ADNc mammalien; b) à ligaturer la banque d'ADNc mammalien avec une phosphatase alcaline de codage d'ADN, à laquelle il manque à la fois une séquence signal et une séquence d'ancrage de membrane, afin de former un ADN ligaturé; c) à transformer des cellules bactériennes avec l'ADN ligaturé, afin de créer une banque de clones de cellules bactériennes; d) à isoler l'ADN comprenant l'ADNc mammalien d'au moins l'un des clones de la banque de clones de cellules bactériennes; e) à transfecter séparément l'ADN isolé des clones de l'étape (d) pour obtenir des cellules mammaliennes qui n'expriment pas la phosphatase alcaline, afin de créer une banque de clones de cellules mammaliennes, dont chaque clone correspond à un clone de la banque de clones de cellules bactériennes; f) à identifier un clone de la banque de clones de cellules mammaliennes qui expriment la phosphatase alcaline; g) à identifier le clone de la banque de clones de cellules bactériennes correspondant au clone de la banque de clones de cellules mammaliennes identifié à l'étape (f); et h) à isoler et à séquencer une partie de l'ADNc mammalien présent dans le clone de la banque de cellules bactériennes identifié à l'étape (g), afin d'identifier un ADNc mammalien codant une protéine mammalienne ayant une séquence signal.
Gearing David Paul
Levinson Douglas Adam
Mccarthy Sean Anthony
Gearing David Paul
Levinson Douglas Adam
Marks & Clerk
Mccarthy Sean Anthony
Millennium Biotherapeutics Inc.
LandOfFree
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