C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/10 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2317896
A method for generating and amplifying closed circular DNA having a specific sequence in vitro in a cell-free system is disclosed. Prior to the invention of this method, closed circular DNA could only be amplified in vivo in appropriate host cells. The essence of the method is the inclusion of a thermostable DNA ligase in a PCR reaction. This procedure is referred to as ligation-during-amplification (LDA), in which the fully extended DNA strands are ligated by the DNA ligase and used as templates for subsequent amplification. Closed circular DNA having a specific sequence can be selectively amplified exponentially by the use of two sequence-specific primers in the LDA reaction. In addition, one or more site-specific mutations can be introduced into a closed circular DNA by the use of one or more mutagenic primers in the LDA reaction. Various thermostable DNA polymerases and thermostable ligases can be used for LDA apmlification. Any primer position and orientation, either inward or outward, can be used in LDA amplification, as long as there is at least one primer complementary to each strand of the circular DNA. This method has applications in the areas of mutagenesis, cloning, DNA detection, DNA modification, genehunting, gene therapy, and cell-free DNA production.
Procédé de production et d'amplification d'ADN circulaire fermé à séquence spécifique in vitro dans un système acellulaire. Avant le procédé selon la présente invention, l'ADN circulaire fermé pouvait être amplifié seulement in vivo dans des cellules hôtes appropriées. Le principe du présent procédé est l'inclusion d'une ligase thermostable dans la réaction de PCR. Ce procédé est qualifié de ligature pendant l'amplification (LDA), lors duquel les brins d'ADN complètement étendus sont ligaturés par la ligase et utilisés comme matrices pour l'amplification ultérieure. De l'ADN circulaire fermé ayant une séquence spécifique peut être sélectivement amplifié de manière exponentielle par l'utilisation de deux amorces spécifiques à des séquences dans la réaction de LDA. De plus, une ou plusieurs mutations spécifiques à des sites peuvent être introduites dans un ADN circulaire fermé par l'utilisation d'une ou plusieurs amorces mutagènes dans la réaction de LDA. Diverses ADN polymérases et ligases thermostables peuvent être utilisées pour l'amplification LDA. Toute orientation et position d'amorce, tant vers l'intérieur que vers l'extérieur, peut être utilisée dans l'amplification LDA, pour autant qu'il existe au moins une amorce complémentaire pour chaque brin de l'ADN circulaire. Ledit procédé trouve des applications dans les domaines de la mutagenèse, du clonage, de la détection d'ADN, de la modification d'ADN, de la recherche de gènes, de la thérapie génique et de la production acellulaire d'ADN.
Chen Zhidong
Ruffner Duane E.
Smart & Biggar
University Of Utah Research Foundation
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1651613