C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/09 (2006.01) C12N 15/00 (2006.01)
Patent
CA 2618665
The present invention relates, e.g., to an in vitro method, using isolated protein reagents, for joining two double-stranded (ds) DNA molecules of interest, wherein the distal region of the first DNA molecule and the proximal region of the second DNA molecule share a region of sequence identity, comprising (a) chewing back the DNA molecules with an enzyme having an exonuclease activity, to yield single-stranded overhanging portions of each DNA molecule which contain a sufficient length of the region of sequence identity to hybridize specifically to each other; (b) specifically annealing the single-stranded overhangs; and (c) repairing single-stranded gaps in the annealed DNA molecules and sealing the nicks thus formed (ligating the nicked DNA molecules). The region of sequence identity generally comprises at least 20 non-palindromic nucleotides (nt), e.g., at least about 40 non-palindromic nt. In some embodiments of the invention, about 5% PEG is present during all steps of the reaction, and/or the repair reaction is achieved with Taq DNA polymerase and a compatible ligase, such as Taq DNA ligase. The method allows the joining of a number of DNA fragments, in a predetermined order and orientation, without the use of restriction enzymes. It can be used, e.g., to join synthetically produced sub-fragments of a gene or genome of interest.
L'invention concerne, entre autres, une méthode "in vitro" mettant en application des protéines réactives isolées et servant à réunir deux molécules d'ADN double brin, la zone distale de la première molécule d'ADN et la zone proximale de la deuxième molécule d'ADN partageant une zone d'identité de séquences, ce qui consiste à: a) malaxer les molécules d'ADN avec un enzyme possédant une activité d'exonucléase afin d'obtenir des parties monocaténaires en surplomb de chaque molécule d'ADN contenant une longueur suffisante de la zone d'identité de séquences, de sorte qu'elles s'hybrident de façon spécifique l'une à l'autre; b) effectuer un recuit spécifique des parties monocaténaires en surplomb; c) réparer les espaces monocaténaires des molécules d'ADN recuites et sceller les coupures simple brin obtenues (ligaturer les molécules d'ADN ayant subi une coupure simple brin). La zone d'identité de séquences comprend généralement au moins 20 nucléotides non palindromiques (nt), par exemple, au moins 40 nucléotides non palindromiques. Dans quelques modes de réalisation, un PEG de 5 % est présent pendant la totalité des étapes de la réaction et/ou la réaction de réparation est exécutée par une polymérase de Taq ADN et une ligase compatible telle qu'une ligase Taq ADN. Cette méthode permet de réunir plusieurs fragments d'ADN dans un ordre et selon une orientation prédéterminés sans utiliser d'enzyme de restriction. On peut la mettre en application, par exemple, afin de réunir des sous-fragments synthétiques d'un gène ou d'un génome.
Gibson Daniel Glenn
Smith Hamilton O.
J. Craig Venter Institute
Mbm Intellectual Property Law Llp
Synthetic Genomics Inc.
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-2014823