C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/70 (2006.01)
Patent
CA 2350168
An improved method for the simultaneous sequence-specific identification of mRNAs in a mRNA population allows the visualization of nearly every mRNA expressed by a tissue as a distinct band on a gel whose intensity corresponds roughly to the concentration of the mRNA. In general, the method comprises the formation of cDNA using anchor primers to fix a 3'-endpoint, producing cloned inserts from the cDNA in a vector containing a bacteriophage-specific promoter for subsequent RNA synthesis, generating linearized fragments of the cloned inserts, preparing cRNA, transcribing cDNA from the cRNA and performing two sequence specific PCR amplifications of the cDNA. In preferred embodiments, the method comprises comparing the length and at least part of the nucleotide sequence of the PCR products to expected values determined from a database of nucleotide sequences. The method can identify changes in expression of mRNA associated with the administration of drugs or with physiological or pathological conditions. Also provided are vectors and primers useful for the practice of the improved method.
Procédé amélioré pour l'identification simultanée, spécifique de séquences, d'ARNm dans une population d'ARNm, qui permet la visualisation de presque chaque ARNm exprimé par un tissu sous forme de bande distincte sur un gel dont l'intensité correspond en gros à la concentration de l'ARNm. En général, ledit procédé consiste à former de l'ADNc à l'aide d'amorces d'ancrage destinées à se fixer sur une terminaison 3', à produire des segments d'insertion clonés à partir de l'ADNc dans un vecteur contenant un promoteur spécifique de bactériophage pour la synthèse subséquente de l'ARN, à produire des fragments linéarisés des segments d'insertion clonés, à préparer l'ARNc, à transcrire l'ADNc à partir de l'ARNc et à effectuer deux amplifications par PCR, spécifiques de séquences, de l'ADNc. Dans des modes de réalisation préférés, ledit procédé consiste à comparer la longueur et au moins une partie de la séquence nucléotidique des produits de PCR à des valeurs attendues déterminées à partir d'une base de données de séquences nucléotidiques. Ledit procédé permet d'identifier des modifications de l'expression de l'ARNm associées à l'administration de médicaments ou à des états physiologiques ou pathologiques. Des vecteurs et des amorces utiles pour la mise en oeuvre dudit procédé sont également décrits.
Hasel Karl W.
Hilbush Brian S.
Digital Gene Technologies Inc.
Mbm Intellectual Property Law Llp
LandOfFree
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