C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/12 (2006.01) A61K 31/70 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01) C07K 14/47 (2006.01) C12N 15/86 (2006.01) C12N 15/861 (2006.01)
Patent
CA 2311642
Multiple binding sites for the transcription factors MAZ and Sp1 within the adenovirus type 5 major late promoter have been identified by DNase I protection studies. In the proximal region of the promoter, both MAZ and Sp1 interact with GC-rich sequences flanking the TATA box. Two MAZ binding sites are centered at -18 and -36 relative to the transcriptional initiation site. Sp1 bound only to the -18 GC-rich sequence. Several sites of interaction were also evident in the distal region of the promoter. Both MAZ and Sp1 interacted with a sequence centered at -166, and MAZ bound weakly to an additional site centered at -130. Over expression of MAZ or Sp1 activated expression from the major late promoter in transient expression assays. Mutational analysis of the GC-rich sequences in the major late promoter suggested that a primary target of MAZ activation is the GC rich sequences flanking the TATA sequence, whereas Sp1 requires the distal GC-rich sequence elements to stimulate gene expression. This activation is enhanced by the adenovirus E1A protein, and evidence for interaction between E1A and both transcription factors was obtained using an immunoprecipitation assay. Activation by MAZ and Sp1 also was observed in transfection studies using the complete adenovirus type 5 genome as the target. Increased levels of late mRNA from both the L1 and L5 regions were observed when MAZ or Sp1 expression plasmids were transfected with viral DNA. Unexpectedly, activation of the major late promoter by MAZ and Sp1 was detected irrespective of whether the viral DNA could replicate.
De nombreux sites de liaison pour les facteurs de transcription MAZ et Sp1 à l'intérieur du promoteur tardif principal de type 5 d'adénovirus ont été identifiés par des études de protection de la DNase I. Dans la région proximale du promoteur, MAZ et Sp1 interagissent tous deux avec des séquences riches en GC adjacentes à la boîte TATA. Deux sites de liaison MAZ sont placés au niveau des positions 18 et 36 par rapport au site promoteur de la transcription. Sp1 se lie uniquement à la séquence riche en GC en position 18. Plusieurs sites d'interaction ont également été observés dans la région distale du promoteur. MAZ et Sp1 interagissent tous deux avec une séquence placée en position 166, et MAZ se lie faiblement à un site supplémentaire placé en position 130. La surexpression de MAZ et de Sp1 active l'expression par le promoteur tardif principal dans les analyses d'expression transitoires. L'analyse de la mutation des séquences riches en GC dans le promoteur tardif principal laisse supposer qu'une cible primaire de l'activation du facteur MAZ correspond aux séquences riches en GC adjacentes à la séquence TATA, alors que le facteur Sp1 a besoin que les éléments des séquences riches en GC stimulent l'expression des gènes. Cette activation est accélérée par la protéine E1A d'adénovirus, et une analyse d'immunoprécipitation a permis de confirmer l'interaction qui existe entre E1A et les deux facteurs de transcription. L'activation de MAZ et de Sp1 a également été observée lors d'analyses de transfection utilisant tout le génome de type 5 de l'adénovirus comme cible. Des niveaux élevés d'ARNm tardif issu à la fois des régions L1 et L5 ont été observés lors de la transfection par de l'ADN viral des plasmides de l'expression des facteurs MAZ et Sp1. Nous avons découvert avec surprise que l'activation du promoteur tardif principal par les facteurs MAZ et Sp1 ne dépendait pas de la capacité de l'ADN viral à se répliquer.
Parks Christopher L.
Shenk Thomas
Ogilvy Renault Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
Princeton University
LandOfFree
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