C - Chemistry – Metallurgy – 12 – P
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
P
C12P 19/34 (2006.01) C12M 1/34 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2373385
The present invention is directed to a method of sequencing a target nucleic acid molecule having a plurality of bases. In its principle, the temporal order of base additions during the polymerization reaction is measured on a molecule of nucleic acid, i.e. the activity of a nucleic acid polymerizing enzyme on the templage nucleic acid molecule to be sequenced is followed in real time. The sequence is deduced by identifying which base is being incorporated into the growing complementary strand of the target nucleic acid by the catalytic activity of the nucleic acid polymerizing enzyme at each step in the sequence of base additions. A polymerase on the target nucleic acid molecule complex is provided in a position suitable to move along the target nucleic acid molecule and extend the oligonucleotide primer at an active site. A plurality of labelled types of nucleotide analogs are provided proximate to the active site, with each distinguishable type of nucleotide analog being complementary to a different nucleotide in the target nucleic acid sequence. The growing nucleic acid strand is extended by using the polymerase to add a nucleotide analog to the nucleic acid strand at the active site, where the nucleotide analog being added is complementary to the nucleotide of the target nucleic acid at the active site. The nucleotide analog added to the oligonucleotide primer as a result of the polymerizing step is identified. The steps of providing labelled nucleotide analogs, polymerizing the growing nucleic acid strand, and identifying the added nucleotide analog are repeated so that the nucleic acid strand is further extended and the sequence of the target nucleic acid is determined.
La présente invention a pour objet un procédé de mise en séquences d'une molécule d'acide nucléique cible comportant plusieurs bases. Dans son principe, l'ordre dans le temps des additions de bases pendant la réaction de polymérisation est mesurée sur une molécule d'acide nucléique, c'est-à-dire, l'activité d'une enzyme de polymérisation de l'acide nucléique sur la molécule d'acide nucléique matrice devant être mise en séquence est suivie en temps réel. La séquence est déduite en identifiant la base qui doit être incorporée dans le brin complémentaire en développement de l'acide nucléique cible par l'activité catalytique de l'enzyme de polymérisation de l'acide nucléique à chaque étape dans la séquence d'additions de bases. Une polymérase sur le complexe de molécule d'acide nucléique cible est prévue dans une position appropriée pour se déplacer le long de la molécule d'acide nucléique cible et prolonger l'amorce d'oligonucléotide dans un site actif. Plusieurs types marqués d'analogues de nucléotides sont prévus à proximité du site actif, chaque type d'analogue de nucléotide pouvant être distingué étant complémentaire d'un nucléotide différent dans la séquence d'acides nucléiques cible. Le brin d'acide nucléique en développement est prolongé en utilisant la polymérase pour ajouter un analogue de nucléotide au brin d'acide nucléique sur le site actif, où l'analogue de nucléotide que l'on ajoute est complémentaire du nucléotide de l'acide nucléique cible sur le site actif. L'analogue de nucléotide ajouté à l'amorce d'oligonucléotide lors de l'étape de polymérisation est identifié. Les étapes consistant à fournir des analogues de nucléotides marqués, à polymériser le brin d'acide nucléique en développement et à identifier l'analogue de nucléotide ajouté sont répétées de telle sorte que le brin d'acide nucléique est encore prolongé et la séquence de l'acide nucléique cible est déterminée.
Craighead Harold G.
Foquet Mathieu
Korlach Jonas
Levene Michael
Turner Stephen
Cornell Research Foundation Inc.
Gowling Lafleur Henderson Llp
LandOfFree
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