C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2322073
The present invention is concerned with a method for generating, in a non specific manner, multiple copies of RNA from a pool of mRNA's. Such a method is of particular importance in techniques for screening the differences in expression in given cell types or in cells under specific conditions. The present invention provides a non-selective poly A mRNA labeling and amplification method, i.e. a method not encompassing cDNA synthesis. The present invention is directed to a method for amplifying RNA by creating, in a non specific manner, multiple RNA copies starting from nucleic acid containing starting material comprising a pool of mRNA's each mRNA comprising a poly-A tail, wherein the material is contacted simultaneously with an oligonucleotide comprising an oligo-dT sequence, the sequence of a promoter recognized by an RNA polymerase and a transcription initiation region which is located between the oligo-dT sequence and the sequence of the promoter, and further with an enzyme having reverse transcriptase activity, an enzyme having RNase H activity and an enzyme having RNA polymerase activity and the necessary nucleotides and the resulting reaction mixture is maintained under the appropriate conditions for a sufficient amount of time for the enzymatic processes to take place. In a preferred method of the invention the generated RNA copies made are contacted with an RNA ligase, a double stranded nucleic acid complex comprising a double stranded DNA promoter sequence that can be recognized by an RNA polymerase, whereby one strand of said complex has a stretch of RNA attached to the 5' end of one of the DNA strands, an enzyme having RNA polymerase activity, and the necessary nucleotides. The resulting reaction mixture is maintained under the appropriate conditions for a sufficient amount of time for the amplification to take place.
La présente invention concerne un procédé de production, de manière non spécifique, de plusieurs copies d'ARN à partir d'un groupe d'ARNm. Un tel procédé revêt une importance toute particulière dans des techniques de criblage de différences d'expression dans des types de cellules donnés ou dans des cellules, dans des conditions spécifiques. La présente invention concerne un marquage de poly A ARNm non sélectif, ainsi qu'un procédé d'amplification, c'est-à-dire un procédé n'impliquant pas la synthèse d'ADNc, et elle concerne notamment un procédé d'amplification d'ARN consistant à créer, de manière non spécifique, plusieurs copies d'ARN à partir d'acide nucléique contenant le matériau de départ composé d'un groupe d'ARNm, chaque ARNm présentant une queue poly-A, à mettre en contact ce matériau simultanément avec un oligonucléotide comprenant une séquence oligo-dT, la séquence d'un promoteur reconnue par une ARN polymérase et une région d'initiation de transcription située entre la séquence oligo-dT et la séquence du promoteur, ainsi qu'avec une enzyme possédant une activité de transcriptase inverse, une enzyme possédant une activité de RNase H et une enzyme possédant une activité d'ARN polymérase et les nucléotides nécessaires, et enfin à maintenir le mélange réactionnel résultant dans des conditions appropriées pendant une période suffisante pour permettre aux processus enzymatiques de s'effectuer. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, on met en contact les copies d'ARN produites, avec une ARN ligase, un complexe d'acide nucléique double brin comprenant une séquence promoteur d'ADN double brin qui peut être reconnue par une ARN polymérase, de sorte qu'un brin de ce complexe possède une extension d'ARN fixée sur l'extrémité 5' de l'un des brins d'ADN, avec une enzyme possédant une activité d'ARN polymérase, et avec les nucléotides nécessaires. Puis on maintient le mélange réactionnel résultant dans des conditions appropriées, pendant une période suffisante pour permettre à l'amplification de s'effectuer.
Fetherstonhaugh & Co.
Pamgene B.v.
LandOfFree
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