G - Physics – 01 – N
Patent
G - Physics
01
N
G01N 33/543 (2006.01) C12N 5/00 (2006.01)
Patent
CA 2705009
Disclosed is a method for purifying at least one target substance that is to be identified and is present or is formed in a cell culture medium when cells are cultivated. In said method, magnetic particles, i.e. beads, to the functionalized surface of which the target substance selectively attaches, are added to the cell culture medium, and the particles to which the target substance is attached are selected out of the cell culture medium by applying a magnetic field. The method is characterized by the following steps: a serum substitute is provided that is obtained from a natural serum and is free or virtually free of low-molecular substances having a maximum mass of 60 kDa, particularly a maximum mass of 10 kDa; the serum substitute is admixed to the cell culture medium which already contains the cells or to which the cells are added; the cells are incubated in the cell culture medium enriched with serum substitute; at least some of the cell culture supernatant formed during the incubation is separated; the cell culture supernatant is filtered by means of an ultrafiltering process so as to obtain a retentate; the beads are supplied in such a way that the functionalized surface of the beads comprises a plurality of dendrimers containing up to 10 branches, i.e. ten generations, the terminal points of the last generation of each dendrimer being modified; the beads and the retentate are admixed to a buffer solution so as to obtain a mixture; the target substances contained in the retentate are incubated and are fixed to the beads; and the magnetic beads are magnetically selected out of the mixture.
L'invention concerne un procédé de purification d'au moins une substance cible à mettre en évidence qui apparaît ou est formée dans un milieu de culture cellulaire lors d'une culture cellulaire, procédé selon lequel des particules magnétiques à surface fonctionnalisée appelées billes sont introduites dans le milieu de culture cellulaire, la substance cible se déposant de manière sélective sur leur surface et les particules dotées de la substance cible étant extraites du milieu de culture cellulaire par application d'un champ magnétique. Le procédé est caractérisé par les opérations suivantes: préparer un succédané de sérum obtenu à partir d'un sérum naturel et ne présentant pas ou peu de substances de faible poids moléculaire de masse inférieure ou égale à 60 kDa, notamment inférieure ou égale à 10 kDa; mélanger le succédané de sérum au milieu de culture cellulaire qui contient déjà les cellules ou dans lequel les cellules ont déjà été introduites; incuber les cellules dans le milieu de culture cellulaire enrichi par le succédané de sérum; séparer au moins une partie d'un excédent de culture cellulaire formé lors de l'incubation; filtrer l'excédent de culture cellulaire par ultrafiltration pour obtenir un rétentat; préparer les billes de manière à ce que leur surface fonctionnalisée présente une pluralité de dendrimères ayant chacun jusqu'à dix ramifications à savoir dix générations, les parties terminales de chaque dernière génération de dendrimères étant modifiée; mélanger les billes et le rétentat dans une solution tampon pour former un mélange; incuber et lier les substances obtenues dans le rétentat aux billes et extraire les billes magnétiques du mélange par sélection magnétique.
Oyen Wiggs Green & Mutala Llp
Peter Jochen
LandOfFree
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