C - Chemistry – Metallurgy – 07 – H
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
07
H
C07H 21/00 (2006.01) A61K 31/70 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C12Q 1/70 (2006.01)
Patent
CA 2215349
A method of amplifying a nucleotide sequence complementary to an mRNA template derived from genomic DNA. The method involves the following steps. A sample mixture containing an mRNA template and corresponding genomic DNA is provided, the genomic DNA including at least two exons separated by at least one intron. A pair of intron-blockers are introduced into the mixture, the intron-blockers comprising a sequence of intron-specific oligonucleotides modified to prevent nucleotide extension in conditions promoting polymerase chain reaction. A primer pair promoting amplification of cDNA derived from the mRNA template is introduced into the mixture and then reverse transcription polymerase chain reaction is carried out to amplify cDNA. Detection of the cDNA is proof of the existence of mRNA in the sample, and thus proof of expression of the corresponding gene. The method avoids false positives caused by amplification of genomic DNA as well as cDNA based on an mRNA template. The invention includes a method of suppressing gene expression in vivo, which comprises exposing cells containing a gene to be suppressed, made up of exons and at least one intron, to intron-blockers having nucleotide sequences that bind to the intron to prevent gene expression.
Divulgation d'une méthode d'amplification d'une séquence de nucléotides complémentaire d'une matrice ARNm obtenue de l'ADN génomique. La méthode comporte les étapes suivantes. Un mélange d'échantillon contenant une matrice ARNm et l'ADN génomique correspondant est divulgué, l'ADN génomique comprenant au moins deux exons séparés par au moins un intron. Une paire de bloqueurs d'intron sont introduits dans le mélange, les bloqueurs d'intron comprenant une séquence d'oligonucléotides spécifiques à l'intron modifiée de manière à empêcher l'élongation des nucléotides dans des conditions favorables à la réaction en chaîne de la polymérase. Une paire d'amorces favorisant l'amplification de l'ADNc obtenu à partir de la matrice ARNm est introduite dans le mélange, puis la réaction en chaîne de la polymérase par transcription inverse est effectuée pour amplifier l'ADNc. La détection de l'ADNc est une preuve de l'existence de l'ARNm dans l'échantillon et, donc, une preuve de l'expression du gène correspondant. La méthode évite les faux résultats positifs causés par l'amplification de l'ADN génomique de même que de l'ADNc basé sur une matrice ARNm. L'invention comprend une méthode de suppression de l'expression génique in vivo, qui consiste à exposer les cellules contenant un gène à supprimer, constitué d'exons et d'au moins un intron, à des bloqueurs d'intron ayant des séquences de nucléotides qui se lient à l'intron pour empêcher l'expression du gène.
Schloss Eric
Vinayagamoorthy Thuraiayah
Kirby Eades Gale Baker
Schloss Eric
Vinayagamoorthy Thuraiayah
LandOfFree
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