C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01)
Patent
CA 2330252
A method of producing a hybrid DNA molecule allowing the assembly of sequences x1, x2.....xn where n is greater than or equal to 3 (e.g. give sequences) from diverse locations into a hybrid molecule for the purpose of mutation analysis. The method comprising the steps of: (1) providing in a single reaction mixture: (a) the sequences x1, x2.......xn and their complementary sequences x1', x2'.........xn', to be assembled into the hybrid molecule; (b) for each pair of complementary sequences defined in (a) a respective pair of PCR primers each having a priming sequence and which are such that the primers hybridising to the 3' ends of any two sequences (xi, x'(i+1)), where i is 1 to (n-1), have specifically complementary linker sequences; (2) effecting a first stage PCR reaction in which those primers provided with linker sequences are present in limiting concentrations; and (3) effecting a second stage PCR reaction using a single pair of primers one of which provides the 5'-end of the sense strand and other of which provides the 3'-end of the anti-sense strand of the required hybrid molecule; whereby said hybrid molecule is generated.
Cette invention est un procédé de production d'une molécule d'ADN hybride permettant de réunir les séquences x¿1?, x¿2?.....x¿n? avec n égal à au moins 3 (cas des séquences donneuses) depuis divers emplacements pour aboutir à une molécule hybride destinée à l'analyse des mutations. Ce procédé de génération de la molécule hybride considérée comporte plusieurs opérations. La première opération consiste notamment (1) à réunir en un seul mélange de réaction, d'une part (a) les séquences x¿1?,x¿2?.......x¿n? et leurs séquences complémentaires x¿1?', x¿2?'.........x¿n?' à assembler pour donner la molécule hybride, et d'autre part, (b) pour chaque paire de séquences complémentaires définie en (a), une paire correspondante d'amorces pour amplification en chaîne par polymérase, chaque paire comportant une séquence d'amorçage et se présentant de façon que les amorces s'hybridant aux extrémités du 3' de chacune des deux séquences (x¿i?, x'¿(i+1)?) comportent des séquences de liaison spécifiquement complémentaires, et ce, pour i valant de 1 à (n-1). La seconde opération consiste (2) à réaliser un premier niveau de réaction d'amplification en chaîne par polymérase dans lequel, celles des amorces qui comportent des séquences de liaison, sont présentes avec des concentrations limitatives. La troisième et dernière opération consiste (3) à effectuer un second niveau de réaction d'amplification en chaîne par polymérase en utilisant une seule paire d'amorces dont l'une fournit l'extrémité du 5' du brin sens et l'autre fournit l'extrémité du 3' du brin antisens de la molécule hybride attendue.
Central Manchester Healthcare Nhs Trust
Marks & Clerk
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-2064340