Method of isolating restriction fragment deletions in vibrio...

Details Method of isolating restriction fragment deletions in vibrio... Method of isolating restriction fragment deletions in vibrio...

C - Chemistry, Metallurgy

12

N

C12N 1/21 (2006.01) C07K 14/28 (2006.01) C12N 1/36 (2006.01)

Patent

CA 2064046

This invention relates to methods of isolating deletion mutants of Vibrio cholerae. In one method, the deletion is predeter- mined by digestion with restriction endonucleases of known specificity. The deletions are inserted into the Vibrio cholerae chrom- osome by in vivo recombination between a plasmid carrying the desired deletion, with adjacent flanking sequences, and the Vibrio cholerae chromosome. In another method, an initial in vivo recombination event of homologous sequences from the recombinant plasmid into the chromosome provides a selectable marker at this site. A second in vivo recombination event between homolo- gous flanking sequences results in excision of proficient genes from the chromosome with the end product being a deletion muta- tion. The invention includes the isolation and characterization of a new Vibrio cholerae strain having a deletion in the ctx gene, as defined by Acc I, Xba I, C?a I and/or restriction endonuclease sites and further having a deletion in the gene encoding zonula occludens toxin.

Procédés servant à isoler des mutants de délétions de Vibrio cholerae. Dans une variante, la délétion est prédéterminée par la digestion avec des endonucléases de restriction de spécificité connue. Les délétions sont insérées dans le chromosome Vibrio cholorae par une recombinaison in vivo entre un plasmide portant la délétion souhaitée, avec les séquences latérales adjacentes, et le chromosome Vibrio cholerae. Dans une autre variante, l'événement de recombinaison in vivo initial de séquences homologues du plasmide recombiné dans le chromomose fournit un marqueur pouvant être choisi sur le site. Un deuxième événement de recombinaison in vivo entre les séquences latérales homologues entraîne l'excision de gènes spécifiques actifs du chromosome, le résultat final étant une mutation de délétion. On décrit aussi l'isolement et la caractérisation d'une nouvelle souche de Vibrio cholerae comportant une délétion dans le gène ctx, comme définie par Acc I, Xba I, Cla I, et/ou des site d'endonucléases de restriction et comportant en outre une déletion dans le gène codant la toxine zonula occludens.

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