C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/10 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2310808
The current invention is a novel approach termed "parallel screening" which allows to simultaneously screen a population for insertions in all genes cloned from that or a closely related organism. In order to test this approach the flowering plant Petunia hybrida was used as a model system. Petunia hybrida line W137 contains a high copy number of the endogenous transposable element dTph1 and has been presented as a genetic tool before (Gerats et al., 1989). A 3D library of the plant genomic DNA of 1000 Petunia hybrida W137 plants was generated as described by Koes et al. (1995). The 3D library consists of 30 pools of DNA from a 100 plants each. These were used to generate 30 pools of insertion flanking sequences by nested iPCR using a set of transposon specific primers or by Transposon Display PCR. Insertions into a gene were detected by hybridizing the amplified insertion flanking sequences fixed to a filter with a gene specific probe, an approach termed simple screening for insertion elements. Alternatively, the amplified insertion element flanking sequences were labeled and used as a probe to hybridize a filter displaying multiple gene targets, an approach termed parallel screening for insertion elements, which allows the simultaneous screening for insertions in all genes of an organism, appearing in a population of insertion mutants.
L'invention porte sur une nouvelle technique dite "criblage en parallèle" permettant de cribler simultanément une population pour des insertions dans tous les gènes clonés à partir de cet organisme ou d'un organisme proche parent. Pour vérifier cette technique, on utilise un Pétunia hybrida en fleurs comme système modèle. La lignée W137 des Pétunia hybrida, qui comporte un nombre élevé de copies de l'élément endogène transposable dTph1, a déjà été présentée comme outil génétique (Gerats et al., 1989). Une bibliothèque en trois D de l'ADN du génome de 1000 Petunia hybrida W137 à été obtenu (décrit par (Koes et al., 1995). La bibliothèque de 3 D consiste en 30 pools d'ADN de 10 plantes chacun servant à produire 30 pools de régions flanquantes d'insertion par PCRi à l'aide d'un ensemble d'amorces spécifiques ou par PCR à présentation de transposons. Les insertions dans un gène se détectent par hybridation des régions flanquantes d'insertion retenues dans un filtre avec une sonde spécifique du gène, selon une technique dite "criblage simple des éléments d'insertion". En variante, les régions flanquantes d'insertion amplifiées ont été étiquetées et utilisées comme sondes pour hybrider des cibles à plusieurs gènes faisant office de filtres. Cette technique dite "criblage en parallèle" des éléments d'insertion permet le criblage simultané des insertions dans tous les gènes d'un organisme apparaissant dans une population de mutants d'insertion.
Gerats Tom
Maes Tamara
Fetherstonhaugh & Co.
Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw
LandOfFree
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