C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2170950
A method of simultaneous determination of the identity of nucleotide bases at specific positions in nucleic acids of interest, which includes (a) treating a sample containing the nucleic acids of interest to obtain unpaired nucleotide bases spanning the specific positions, if the nucleic acids are not already single stranded; (b) contacting the unpaired nucleotide bases with combinations of various marked oligonucleotide primers each for hybridizing with a stretch of nucleotide bases present in each nucleic acid of interest immediately adjacent the nucleotide base to be identified, so as to form a duplex between the primer and the nucleic acid of interest such that the nucleotide base to be identified is the first unpaired base in the template immediately 5' of the nucleotide base annealed with the 3'-end of the primer in the duplex; (c) contacting the duplex with the reagent which includes an aqueous carrier, and atleast one primer extension unit, the primer extension unit including an extension moiety a separation moiety and a detection moiety, with the extension moiety for specifically halting a nucleic acid template dependent, primer extension reaction, in a manner which is strictly dependent on the identity of the unpaired nucleotide base of the template immediately adjacent to, and 3' of, the 3'-end of the primer, with the separation moiety permitting the affinity separation of theprimer extension unit from unincorporated, or non-extended, primers, and with the detection moiety enabling the direct or indirect detection of the presence of a primer extension unit the contacting taking place under conditions permitting the base pairing of the complementary extension moiety of the primer extension unit present in the reagent with the nucleotide base to be identified and the occurence of a template dependent, primer extension reaction to incorporate the extension moiety of the primer extension unit at the 3'-end of the primer, resulting in the extension of the primer by a single unit; (d) removing the non-extended marked primer; (e) determining the presence of a nucleotide alteration; and (f) determining the identity of the extended primers, and therefore the kindof alterations and the complete genotype of the examined nucleic acid, by hybridizing the extended primers to complementary oligonucleotides adhered to a test surface.
Méthode de détermination simultanée de l'identité des bases nucléotidiques dans des positions spécifiques dans les acides nucléiques d'intérêt, qui comporte (a) le traitement d'un échantillon contenant les acides nucléiques d'intérêt pour obtenir des bases nucléotidiques non appariées couvrant les positions spécifiques, si les acides nucléiques ne sont pas déjà monocaténaires; (b) la mise en contact des bases nucléotidiques non appariées avec des combinaisons de diverses amorces oligonucléotidiques marquées pour hybridation avec un segment de bases nucléotidiques présent dans chacun des acides nucléiques d'intérêt immédiatement adjacent par rapport à la base nucléotidique à identifier, de manière à former un duplex entre l'amorce et l'acide nucléique d'intérêt de manière que la base nucléotidique à identifier soit la première base non appariée dans la matrice, immédiatement, l'extrémité 5' de la base nucléotidique s'hybridant par annelage à l'extrémité 3' de l'amorce dans le duplex; (c) la mise en contact du duplex avec le réactif qui comprend un porteur aqueux et au moins une séquence d'extension d'amorce, la séquence d'extension d'amorce comprenant une fraction d'extension, une fraction de séparation et une fraction de détection, la fraction d'extension servant spécifiquement à stopper la réaction d'extension de l'amorce dépendante de la matrice d'acide nucléique d'une manière qui est strictement dépendante de l'identité de la base nucléotidique non appariée de la matrice immédiatement adjacente à l'extrémité 3' de l'amorce, la fraction de séparation permettant la séparation par affinité de la séquence d'extension d'amorce des amorces non incorporées, ou non étendues, et la fraction de détection permettant la détection directe ou indirecte de la présence d'une séquence d'extension d'amorce, la mise en contact ayant lieu dans des conditions permettant l'appariement des bases de la fraction d'extension complémentaire de la séquence d'extension d'amorce présente dans le réactif avec la base nucléotidique à identifier ainsi que le déroulement d'une réaction d'extension de l'amorce dépendante de la matrice d'acide nucléique pour incorporer la fraction d'extension de la séquence d'extension d'amorce à l'extrémité 3' de l'amorce, entraînant une extension de l'amorce par une seule base; (d) l'élimination de l'amorce marquée non étendue; (e) la détermination de la présence d'une modification nucléotidique; et (f) la détermination de l'identité des amorces étendues et, par conséquent, le type de modifications et le génotype complet de l'acide nucléique examiné, par hybridation des amorces étendues avec les oligonucléotides complémentaires qui adhèrent à la surface d'essai.
Eyal Nurit
Navot Nir
Bereskin & Parr
Diagenetics Gamidor Ltd.
LandOfFree
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