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C - Chemistry, Metallurgy

12

Q

C12Q 1/68 (2006.01) C07H 21/00 (2006.01)

Patent

CA 2194696

Reliable and cost effective testing for mutations in the RB1 gene can be accomplished by: (a) quantitatively amplifying exons of the sample RB1 gene using primers complementary to intron regions flanking each exon; and (b) determining the lengths and/or quantities of the amplification products for each exon and comparing that length or quantity to the length or quantity of amplification products obtained when a wild-type RB1 gene is amplified using the same primers. Differences in length between an amplified sample exon and the corresponding amplified wild-type exon reflect the occurrence on an insertion or deletion mutation in the sample RB1 gene. Differences in quantity reflect the complete absence of an exon, or heterozygosity for a mutant exon. Next, the nucleic acid sequence of each exon found to contain an insertion or deletion mutation is determined, or of all exons in the event no insertion or deletion mutations are identified. Preferably, the amplification of the exons is multiplexed so that more than one exon is amplified in a single vessel using sets of primers which provide gene fragments of distinctive lengths when used to amplify a normal RB1 gene.

Procédé de test fiable et rentable utilisé pour détecter des mutations dans le gène RB1. Ce procédé consiste: (a) à amplifier quantitativement les exons du gène RB1 échantillon à l'aide d'amorces complémentaires de régions d'intron situées sur les côtés de chaque exon; et (b) à déterminer les longueurs et/ou les quantités des produits d'amplification de chaque exon et à comparer cette longueur ou cette quantité à celle des produits d'amplification obtenus lorsqu'un gène RB1 du type sauvage est amplifié à l'aide des mêmes amorces. Des différences de longueur entre un exon échantillon amplifié et l'exon de type sauvage amplifié correspondant reflètent l'occurrence lors d'une mutation par insertion ou délétion dans le gène RB1 échantillon. Des différences de quantité reflètent l'absence totale d'exon ou l'hétérozygosité d'un exon mutant. On détermine ensuite la séquence nucléotidique de chaque exon dans lequel on a découvert une mutation par insertion ou délétion, ou bien tous les exons dans le cas où aucune mutation par insertion ou délétion n'a été identifiée. De préférence, l'amplification des exons est multiplexée de sorte que plus d'un exon soit amplifié dans une seule cuve à l'aide du groupe d'amorces qui produit des fragments de gène de longueurs distinctes lorsqu'on les utilise pour amplifier un gène RB1 normal.

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