C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12Q 1/48 (2006.01)
Patent
CA 2505871
A method for determining telomerase activity using primer extension followed with real time PCR quantification is disclosed. The method of the present invention provides a rapid, sensitive and accurate measurement for telomerase activity in a biological sample. In one embodiment, the method includes the steps of: adding the biological sample to a reaction tube containing a first reaction mixture having a first primer and nucleoside triphosphates, a second reaction mixture having a second primer and a DNA polymerase, and a wax layer that separates the first reaction mixture from the second reaction mixture; incubating the biological sample with the first reaction mixture; admixing the extension product with the second reaction mixture; amplifying and quantifying the extension product using real-time PCR and a control template. In another embodiment, the detection method includes an in situ primer extension step that allows the production of the extension product within an intact cell. In this embodiment, the extension product can be preserved under appropriate conditions for an extended time before the completion of the quantification step.
L'invention concerne un procédé pour déterminer l'activité de la télomérase au moyen d'une extension d'amorce, suivie d'une quantification par une réaction PCR en temps réel. Le procédé de l'invention permet d'effectuer une mesure rapide, efficace et convenable de l'activité de la télomérase dans un échantillon biologique. Dans un mode de réalisation, le procédé comprend les étapes suivantes : ajouter l'échantillon biologique dans un tube de réaction contenant un premier mélange de réaction présentant une première amorce et des triphosphates de nucléosides, un second mélange de réaction présentant une seconde amorce et une polymérase d'ADN, et une couche de cire séparant le premier mélange de réaction et le second mélange de réaction ; laisser incuber l'échantillon biologique avec le premier mélange de réaction ; mélanger le produit d'extension avec le second mélange de réaction ; amplifier et quantifier le produit d'extension à l'aide d'une réaction PCR en temps réel et d'un modèle témoin. Dans un autre mode de réalisation, le procédé de détection comprend une étape d'extension de l'amorce in situ, ce qui permet la production du produit d'extension à l'intérieur d'une cellule intacte. Dans ce mode de réalisation, le produit d'extension peut être conservé dans des conditions appropriées, sur une longue période, avant la fin de l'étape de quantification.
Bao Jun
Li Lina
Li Zhuangwu
Ma Wenbin
Mao Hua
Allied Biotech Inc.
Riches Mckenzie & Herbert Llp
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1987733