C - Chemistry – Metallurgy – 12 – P
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
P
C12P 21/06 (2006.01) C12N 1/14 (2006.01) C12N 1/16 (2006.01) C12N 15/00 (2006.01)
Patent
CA 2534360
In one aspect the present invention relates to a method of expressing an immunotoxin in Pichia pastoris strain mutated to toxin resistance comprising a) growing the Pichia pastoris in a growth medium comprising an enzymatic digest of protein and yeast extract and maintaing a dissolved oxygen concentration at 40% and above; and b) performing methanol induction with a limited methanol feed of 0.5-0.75 ml/min/ 10L of initial volume during induction along with a continuous inusion of yeast extract at a temperature below 17.5 ~C., antifoaming agent supplied up to 0.07%, agitation reduced to 400 RPM, and the induction phase extended out to 163 h. In another aspect, the present invention relates to a method of purifying a non~glycosylated immunotoxin comprising a) loading a solution containing the non~glycosylated immunotoxin onto a hydrophobic interaction column; b) obtaining a first non- glycosylated immunotoxin containing eluant from the hydrophobic interaction column; c) loading the non-glycosylated immunotoxin containing eluant from step (b) onto an anion exchange column; d) obtaining a second non-glycosylated immunotoxin containing eluant from the anion exchange column by eluting the non-glycosylated immunotoxin with a sodium borate solution; e) diluting the concentration of sodium borate in the second non-glycosylated immunotoxin containing eluant from step (d) to about 50 mM or less; f) concentrating the diluted non-glycosylated immunotoxin containing eluant from step (e) over an anion exchange column; and g) obtaining a purified non-glycosylated immunotoxin from the anion exchange column.
Dans un aspect, la présente invention se rapport à un procédé permettant d'exprimer une immunotoxine dans une souche de Pichia Pastoris qui a subi une mutation pour présenter une résistance à la toxine. Ledit procédé consiste : a) à faire croître Pichia Pastoris dans un milieu de croissance contenant un digesté enzymatique d'une protéine et d'un extrait de levure, et à maintenir une concentration d'oxygène dissous égale ou supérieure à 40 % ; et b) à effectuer une induction par le méthanol, avec un apport de méthanol limité, égal à 0,5-0,75 ml/mn 10l du volume initial, pendant l'induction, conjointement avec une infusion continue de l'extrait de levure à une température inférieure à 17,5 ·C, un agent antimoussant étant fourni à hauteur de 0,07 %, l'agitation étant réduite à 400 RPM, et la phase d'induction s'étendant sur 163 h. Dans un autre aspect, l'invention a trait à un procédé permettant de purifier une immunotoxine non glycosylée, qui consiste : a) à charger une solution contenant l'immunotoxine non glycosylée dans une colonne d'interaction hydrophobe ; b) à extraire un premier éluant contenant l'immunotoxine non glycosylée de la colonne d'interaction hydrophobe ; c) à charger l'éluant contenant l'immunotoxine non glycosylée de l'étape (b) dans une colonne d'échange d'anions ; d) à extraire un second éluant contenant l'immunotoxine non glycosylée de la colonne d'échange d'anions en éluant l'immunotoxine non glycosylée avec une solution de borate de sodium ; e) à diluer la concentration de borate de sodium dans le second éluant contenant l'immunotoxine non glycosylée de l'étape (d) à environ 50 mM ou moins ; f) à concentrer l'éluant contenant l'immunotoxine non glycosylée de l'étape (e) dans une colonne d'échange d'anions ; et g) à extraire une immunotoxine non glycosylée purifiée de la colonne d'échange d'anions.
Liu Yuan-Yi
Neville David M.
Woo Jung-Hee
Gowling Lafleur Henderson Llp
National Institutes Of The Government Of The United States Of America As Represented By
LandOfFree
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