C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C07H 21/00 (2006.01) C07H 21/02 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) C12Q 1/70 (2006.01) G01N 33/53 (2006.01)
Patent
CA 2386913
Methods of nucleic acid amplification with external controls are provided that verify the absence or presence of specific target sequences, and correct primers and probes. A single-stranded, external control polynucleotide is amplified with primers of the same sequence as target primers. Probes with detectable labels and sequences specific for target and external control polynucleotides allow for detection and measurement. The primers and the detectable probe are adjacent or substantially adjacent when hybridization of a self-quenching probe complementary to both target and external control polynucleotides. A kit of PCR reagents can be dispensed into vessels for rapid and accurate nucleic acid amplification assay, with real-time or end-point measurements. The amplification control reagents, kits, and methods of the present invention provide positive and negative control tests which can be conducted concurrently with target amplification. Allelic differences at genetic loci can be detected, including single nucleotide polymorphisms (SNP).
La présente invention concerne des méthodes d'amplification d'acides nucléiques faisant intervenir des contrôles externes qui permettent de vérifier la présence ou l'absence de séquences cibles spécifiques, et de corriger des amorces et des sondes. Un polynucléotide monocatenaire de contrôle externe est amplifié avec des amorces de même séquence, notamment des amorces cibles. Des sondes à marqueurs détectables et des séquences spécifiques aux polynucléotides cibles et de contrôle externe permettent de réaliser des opérations de détection et de mesure. Les amorces et la sonde détectable sont adjacentes ou sensiblement adjacentes lorsqu'elles sont hybridées au polynucléotide de contrôle externe. On peut détecter des amplicons cibles et des amplicons de contrôle par la fluorescence accrue induite par le clivage de la nucléase 5' à médiation polymérase ou par l'hybridation d'une sonde à désactivation automatique complémentaire à la fois aux polynucléotides cibles et aux polynucléotides de contrôle externe. Un kit de réactifs PCR peut être introduit dans des récipients pour réaliser un essai d'amplification rapide et précis, avec des mesures en temps réel ou de point final. Les réactifs de contrôle d'amplification, les kits, et les méthodes de l'invention permettent de réaliser des tests de contrôle positifs et négatifs simultanément avec l'amplification cible. Par ailleurs, on peut détecter des différences alléliques dans des locus génétiques, notamment des polymorphismes mononucléotidiques (SNP).
Heid Christian
Livak Kenneth J.
Applera Corporation
Pe Corporation (ny)
Sim & Mcburney
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1825877