C - Chemistry – Metallurgy – 07 – K
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
07
K
C07K 14/71 (2006.01) A61K 38/18 (2006.01) A61K 47/10 (2006.01) C07K 1/14 (2006.01) C07K 14/505 (2006.01) C12P 21/00 (2006.01) G01N 33/566 (2006.01) A61K 38/00 (2006.01) A61K 47/12 (2006.01) A61K 47/18 (2006.01) A61K 47/20 (2006.01)
Patent
CA 2243577
The extracellular domain of the human erythropoietin receptor (EPO binding protein, EBP) has been expressed and overproduced in E. coli. Control of oxygen levels and pH during high density fermentation allows the production of only the protein variant with the native amino terminus. Methods disclosed permit the efficient recovery of purified EBP which quantitatively binds EPO. The active purified protein competes with membrane associated EPO receptor for binding [125I]EPO and neutralizes EPO dependent stimulation in a cell based proliferation assay. Further, the radioligand equilibrium binding constant for this interaction has been determined by immobilizing EBP on agarose gel via a free cysteine. The EBP of the present invention has many uses including the structural determination of the protein by NMR or crystallography, in drug design and discovery, and as a therapeutic. A fusion protein of EBP and an immunoglobulin heavy chain was also produced. This protein, termed EBP-Ig, is a preformed dimerization template and is also useful in drug design and discovery methods.
Le domaine extracellulaire du récepteur de l'érythropoïétine (protéine de fixation de l'EBO dite EBP) a été exprimé et surproduit dans E.coli. En régulant la concentration en oxygène et le pH pendant la fermentation on ne permet que la production de certaines variantes de protéines à terminaison amino native. Les procédés exposés permettent une bonne récupération de l'EBP purifié qui se fixe quantitativement à l'EPO. La protéine active purifiée concurrence le récepteur de l'EPO associé à la membrane pour se fixer à l'[<125>I] EPO et neutralise la stimulation dépendante de l'EPO dans un test de prolifération cellulaire. De plus la constante de fixation de l'équilibre des radioligands de cette interaction a été déterminée par immobilisation d'EPB sur gel d'agarose par l'intermédiaire d'une cystéine libre. L'EBP de l'invention a de nombreuses utilisations en matière de détermination de la structure des protéines par RMN ou cristallographie, de conception et de découverte de médicaments, et de thérapie. Une protéine de fusion de l'EBP et une chaîne lourde d'hémoglobine ont également été obtenues; ladite protéine, dite EBP-Ig, est une matrice préformée de dimérisation, également utile en matière de conception et de découverte de médicaments.
Johnson Dana
Jolliffe Linda K.
Mcmahon Frank J.
Middleton Steven A.
Mulkahy Linda S.
Ortho Pharmaceutical Corporation
Ortho-Mcneil Pharmaceutical Inc.
Smart & Biggar
LandOfFree
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