G - Physics – 01 – N
Patent
G - Physics
01
N
G01N 33/573 (2006.01) C12N 15/62 (2006.01) G01N 33/542 (2006.01)
Patent
CA 2450641
The present invention provides methods of screening for ligands of target molecules. The methods of the present invention include assays in which a target molecule is subjected to denaturing conditions, and compounds are screened for the ability to alter the susceptibility of the target to unfolding. The methods of the present invention use fluorescence detection to determine that degree of unfolding of a target molecule. In some aspects of the present invention, fluorescence resonance energy transfer (FRET) is detected. In other aspects of the invention, fluorescence polarization (FP) is detected. In preferred embodiments, a target molecule such as a target protein is heated to a temperature, called TATLAS, at which at least a portion of the target molecule unfolds, in the presence of a test compound. In some embodiments of the present invention, the degree of unfolding of the target molecule is determined by binding of a specific binding member specific for the unfolded form of a target molecule that is coupled to a fluorophore that can participate in FRET. In some other embodiments of the present invention, the degree of unfolding of a target molecule is determined by FRET detection of aggregates of the target molecule. In yet other embodiments of the present invention, the degree of unfolding of a target molecule is determined by detection of fluorescence polarization of aggregates of the target molecule. The present invention provides sensitive, high throughput screens for identifying ligands of target molecules that are not dependent on the identity or function of the target.
La présente invention concerne des procédés destinés au criblage de ligands de molécules cibles. Les procédés de l'invention comprennent des essais au cours desquels une molécule cible est exposée à des conditions de dénaturation, et des composés subissent un criblage vis-à-vis de la capacité à agir sur la tendance au dépliement de la molécule cible. Les procédés de l'invention font intervenir la détection de fluorescence pour déterminer le degré de dépliement d'une molécule cible. Dans certains aspects de l'invention, le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) est détecté. Dans d'autres aspects de l'invention, la polarisation de fluorescence (FP) est détectée. Dans des modes de réalisation préférés, une molécule cible telle qu'une protéine cible est chauffée à une température, notée T¿ATLAS?, à laquelle au moins une partie de la molécule cible se déplie, en la présence d'un composé d'essai. Dans certains modes de réalisation de la présente invention, le degré de dépliement de la molécule cible est déterminé par liaison d'un élément de liaison donné spécifique de la forme dépliée d'une molécule cible couplée à un fluorophore qui peut participer au FRET. Dans certains autres modes de réalisation de l'invention, le degré de dépliement d'une molécule cible est déterminé par une détection de FRET d'agrégats de la molécule cible. Dans d'autres modes de réalisation de l'invention, le degré de dépliement d'une molécule cible est déterminé par une détection de polymérisation de fluorescence d'agrégats de la molécule cible. L'invention a également pour objet des systèmes de criblage sensibles à rendement élevé destinés à l'identification de ligands de molécules cibles qui ne dépendent pas de l'identité ou de la fonction de la molécule cible.
Coyle Joseph
Djaballah Hakim
Li Bin
Patel Rupal
Rongey Scott
Anadys Pharmaceuticals Inc.
Ridout & Maybee Llp
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1969165