C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2340306
The present invention provides a method of detecting nucleotide variation within a first nucleic acid, comprising generating a set of single-stranded extension products from a first nucleic acid in the presence of modified nucleotide bases, wherein the extension products incorporate modified nucleotides and thereby limit exonuclease activity to the 3'-terminal nucleotide base, and wherein the extension products have variable lengths, hybridizing the variable length extension products to a reference nucleic acid, contacting the hybridizing nucleic acids with an enzyme which can remove and replace the 3'-terminal nucleotide of the extension products in the presence of selected labeled nucleotides, wherein extension products that terminate with a 3'-nucleotide that does not hybridize with the corresponding position on the reference nucleic acid are replaced with one or more nucleotides that hybridize with the corresponding nucleotides on the reference nucleic acid and wherein those extension products that had a non-hybridizing nucleotide at the 3'-terminus can now be distinguished from those extension products that had a hybridizing nucleotide at the 3'-terminus, and distinguishing those extension products that had a non-hybridizing nucleotide at their 3'-terminus from those extension products that had a hybridizing nucleotide at their 3'-terminus, thereby detecting nucleotide variation in the first nucleic acid. Alternatives of this method are also provided which can also detect mutations in a nucleic acid at the penultimate 3'-terminal position on the single-stranded extension products.
La présente invention concerne un procédé de détection des variations de nucléotides dans un premier acide nucléique. Ce procédé consiste à générer un ensemble de produits d'extension à un seul brin à partir d'un premier acide nucléique en présence de bases de nucléotides modifiées, selon lequel les produits d'extension comprennent des nucléotides modifiés, ce qui limite l'activité de l'exonucléase à la base des nucléotides à terminaison 3', et selon lequel les produits d'extension présentent des longueurs variables. Ce procédé consiste ensuite à hybrider les produits d'extension de longueur variable à un acide nucléique de référence, à placer les acides nucléiques en cours d'hybridation en contact avec une enzyme qui peut enlever et remplacer le nucléotide à terminaison 3' des produits d'extension en présence de nucléotides marqués sélectionnés, les produits d'extension qui se terminent avec un nucléotide-3' qui ne s'hydride pas avec la position correspondante sur l'acide nucléique de référence sont remplacés par un ou plusieurs nucléotides qui s'hybrident avec les nucléotides correspondant sur l'acide nucléique de référence, et -es produits d'extension qui présentaient un nucléotide sans hybridation au niveau de la terminaison 3' peuvent maintenant être différenciés de ceux qui possédaient un nucléotide en cours d'hybridation au niveau de la terminaison 3'. Ce procédé consiste ensuite à distinguer les produits d'extension possédant un nucléotide ne s'hybridant pas au niveau de la terminaison 3' de ceux possédant un nucléotide s'hydridant au niveau de cette même terminaison 3', ce qui permet de détecter la variation des nucléotides dans le premier acide nucléique. D'autres modes de réalisation du procédé sont également décrits, qui permettent de détecter aussi des mutations dans un acide nucléique au niveau de la pénultième position terminale 3' sur les produits d'extension à un seul brin.
Genetic Assays Inc.
Gowling Lafleur Henderson Llp
Insight Genetics Inc.
LandOfFree
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