C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/85 (2006.01) C07K 14/505 (2006.01)
Patent
CA 2592100
The invention provides compositions comprising one or more isoforms of an erythropoietin (EPO) comprising glycans linked thereto, characterized in that said glycans comprise LewisX structures and on average at least 6 sialic acid moieties per EPO molecule. The invention further provides methods for obtaining a composition comprising one or more isoforms of an erythropoietin (EPO) comprising glycans linked thereto wherein said glycans comprise on average at least 6 sialic acids per EPO molecule and from 0 to 2 Lewis x structures, said method comprising: a) providing a eukaryotic cell containing a nucleic acid sequence encoding an adenoviral E1A protein in expressible format and further containing a nucleic acid encoding an EPO in expressible format, wherein said cell further contains a nucleic acid sequence encoding a sialyltransferase, preferably an alpha-2,6-sialyltransferase or an alpha-2,3- sialyltransferase, under control of a heterologous promoter; b) culturing said cell in a serum-free culture medium and allow expression of an EPO in said cell; c) harvesting the expressed EPO from said cell and/or from the culture medium; and d) purifying and fractionating the EPO to obtain fractions which have an increased average sialic acid content of the N-linked glycans per EPO molecule, to obtain a composition comprising one or more iso forms of an EPO comprising glycans linked thereto wherein said glycans co mprise on average at least 6 sialic acids per EPO molecule and from 0 to 2 Lewis x structures.
L'invention propose des compositions comprenant un ou plusieurs isoformes d'une érythropoïétine (EPO) à laquelle sont liés des glycanes, cette EPO étant caractérisée par le fait que lesdits glycanes comprennent des structures de Lewis X et, en moyenne, au moins 6 fragments d'acide sialique par molécule d'EPO. L'invention propose en outre des procédés d'obtention d'une composition comprenant un ou plusieurs isoformes d'une érythropoïétine (EPO) à laquelle sont liés des glycanes, lesdits glycanes comprenant en moyenne au moins 6 fragments d'acide sialique par molécule d'EPO et de 0 à 2 structures de Lewis x, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a fourniture d'une cellule eucaryote contenant une séquence d'acide nucléique codant une protéine adénovirale E1A en un format exprimable et contenant en outre un acide nucléique codant une EPO en un format exprimable, ladite cellule contenant en outre une séquence d'acide nucléique codant pour une sialyl-transférase, de préférence une alpha-2,6-sialyl-transférase ou une alpha-2,3-sialyl-transférase, sous le contrôle d'un promoteur hétérologue ; b) mise en culture de ladite cellule dans un milieu de culture sans sérum et permettant l'expression d'une EPO dans ladite cellule ; c) récolte de l'EPO exprimée à partir de ladite cellule et/ou du milieu de culture ; et d) purification et fractionnement de l'EPO afin d'obtenir des fractions présentant une teneur moyenne accrue en acide sialique des glycanes à liaison N par molécule d'EPO, afin d'obtenir une composition comprenant un ou plusieurs isoformes d'une EPO à laquelle sont liés des glycanes, lesdits glycanes comprenant en moyenne au moins 6 acides sialiques par molécule d'EPO et de 0 à 2 structures de Lewis x.
Borden Ladner Gervais Llp
Crucell Holland B.v.
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