C - Chemistry – Metallurgy – 12 – P
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
P
C12P 19/34 (2006.01) C12Q 1/70 (2006.01)
Patent
CA 2638900
A real-time assay coupled with a non-invasive tissue sampling was developed for the detection and quantification of fish viruses. As a proof of principles, data were presented for the detection and quantification of infectious hypodermal necrosis virus (IHNV) in trout. The primers were designed for IHNV nucleocapsid (N), and surface glycoprotein (G) genes, and trout .beta.-actin and elongation factor- l.alpha. (EF-I .alpha.) were used as internal control for the assay. The reaction conditions for the real-time RT- PCR were optimized using cDNA derived from IHNV-infected Epithelioma papulosum cyprinid (EPC) cells. Using both N- and G-gene primers, IHNV was successfully detected in liver, kidney, spleen, adipose tissue and pectoral fin samples of laboratory-challenged and wild samples. The dissociation curves with a single melting peak at expected temperature (85 ~C for the N-gene and 86.5 ~C for the G-gene) confirmed the specificity of the N- and G- gene amplicons. The IHNV N- and the G-gene expression levels in different tissues of laboratory challenged samples were in the order of spleen, liver, kidney, adipose tissue and pectoral fin, however in the field- collected samples the order of gene expression was liver, kidney, pectoral fin, adipose tissue, and spleen. The N- and G-gene expressions in spleen were found to be dramatically lower in the field-collected samples compared to the laboratory-challenged samples indicating a potential difference in the IHNV replication in the laboratory as opposed to field conditions. The real-time PCR assay was found to be rapid, highly sensitive, and reproducible. Based upon the ability to detect the virus in pectoral fins a non-invasive detection method for IHNV and other fish viruses is developed. Such a non-invasive tissue sampling coupled with real- time PCR assay is very valuable for large-scale virus screening of fish in aquaculture facilities as well as for epidemiological studies.
L'invention concerne un essai en temps réel comprenant l'échantillonnage de tissus non invasifs, développé pour la détection et la quantification des virus frappant les poissons. Dans la démonstration du principe, des données concernant la détection et la quantification du virus de la nécrose hypodermique infectieuse chez la truite sont présentées. Les amorces sont créées pour un nucléocapside (N) d'IHNV, et des gènes (G) de la glycoprotéine de surface, et la ß-actine de la truite et le facteur 1a- d'élongation (EF- Ia) sont utilisés comme moyen de contrôle interne pour l'essai. Les conditions de réaction pour la PCR en temps réel sont optimisées au moyen d'un ADNc dérivé des cellules de l'épithéliome papulosum des cyprinidés (EPC). Grâce aux amorces des gènes N et G, l'IHNV est détecté dans des échantillons du foie, du rein, de la rate, des tissus adipeux et des nageoires pectorales provenant d'échantillons sauvages et élevés en laboratoire. Les courbes de dissociation présentant un pic de fusion simple à une température souhaitée (85 °C pour le gène N et 86,5 °C pour le gène G) confirment la spécificité des amplicons desdits gènes N et G. Les niveaux d'expression des gènes G et N de l'IHNV dans différents tissus d'échantillons élevés en laboratoire sont dans l'ordre : la rate, le foie, le rein, les tissus adipeux et la nageoire pectorale, alors que pour les échantillons prélevés dans le milieu, l'ordre de l'expression du gène est : le foie, le rein, la nageoire pectorale, les tissus adipeux et la rate. Les expressions des gènes G et N détectées dans la rate sont dramatiquement inférieures dans les échantillons prélevés dans le milieu à celles des échantillons prélevés en laboratoire, ce qui indique une différence potentielle dans la réplication de l'IHNV en laboratoire par rapport aux conditions dans le milieu. Sur la base de la capacité à détecter le virus dans les nageoires pectorales, un procédé de détection non invasif est utilisé pour l'IHNV ainsi que pour d'autres virus frappant les poissons. L'échantillonnage des tissus non invasif couplé à un essai par PCR est tout à fait valable pour un criblage du virus à grande échelle chez les poissons, dans des installations aquacoles ainsi que dans des études épidémiologiques.
Advanced Bionutrition Corporation
Dhar Arun
Mckay-Carey & Company
LandOfFree
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