C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2346146
The present invention relates to the demonstration that a modification of a homopolymeric stretch in an oligonucleotide, or primer, improves the discrimination for binding of such a modified oligonucleotide or primer to its complementary homopolymeric target sequence, as compared to a non- homopolymeric sequence. More specifically, an oligo d(T) primer having two of the thymine bases substituted by 3-nitropyrrole were used in a poly A primed cDNA synthesis experiment to demonstrate an improvement in discrimination between the priming of cDNA synthesis from bona fide poly A sequence as compared to internal A-rich sequences. The present invention relates to modifications of homopolymeric sequences in oligos, decreasing the ridging bonding capacity, in general, since other modifications, such as an oligo d(T) primer substituted with 2' deoxyinosine was also shown to improve the discrimination between the binding to a bona fide poly A tail as compared to A- rich sequences. The present invention thus relates to universal primers which reduce mispriming during cDNA library construction, thereby increasing the proportion of cDNA clones having been primed from the bona fide 3' poly A tail. The present invention further relates to the use of the discriminating oligonucleotides of the present invention in other methods such as mRNA purification, PCR-based detection methods and sequencing.
L'invention constitue la preuve qu'en modifiant une extension homopolymère dans un oligonucléotide, ou amorce, on améliore la discrimination de la liaison dudit nucléotide ou de ladite amorce modifié(e) avec sa séquence cible homopolymère complémentaire par rapport à une liaison avec une séquence non homopolymère. Plus spécifiquement, on a utilisé une amorce oligo d(T), dans laquelle deux des bases thymine ont été substituées par un 3-nitropyrrole, pour réaliser une expérience de synthèse d'ADNc amorcée par un poly A prouvant que la discrimination de l'amorçage de la synthèse d'ADNc à partir de la séquence poly A bona fide est supérieure à celle obtenue avec des séquences internes riches en A. L'invention concerne des modifications de séquences homopolymères dans les oligos, diminuant la capacité de liaison par pontage, en général, puisqu'il a été démontré que d'autres modifications, telles que la substitution d'une amorce oligo d(T) par la 2' désoxy-inosine, améliorent également la discrimination de la liaison avec une queue poly A bona fide par rapport à une liaison avec des séquences riches en A. L'invention concerne donc des amorces universelles qui diminuent les erreurs d'amorçage lors de la création d'une banque d'ADNc, ce qui augmente la proportion de clones d'ADN amorcés à partir d'une queue 3' poly A bona fide. Elle concerne aussi l'utilisation des oligonucléotides discriminants de la présente invention dans d'autres techniques telles que la purification de l'ARNm, les méthodes de détection basées sur la PCR et le séquençage.
Das Manjula
Pelletier Jerry
Das Manjula
Goudreau Gage Dubuc
Pelletier Jerry
University Mcgill
LandOfFree
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