C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/88 (2006.01) G01N 33/50 (2006.01)
Patent
CA 2571130
The present invention provides a method to identify a test compounds capability to modulate p75NTR induced apoptosis, said method comprising: i. Transfecting a suspension of eukaryotic cells with a vector encoding p75NTR (SEQ ID No.2) or a cell death inducing fragment thereof, ii. Contacting said cells with the compound to be tested, and iii. Determine the apoptotic response in said cells, wherein an alteration in apoptotic response in the presence of said test compound compared to the apoptotic response in the absence of the test compound is an indication of the ability of the test compound to modulate p75NTR induced apoptosis. In this method according to the invention the suspension of eukaryotic cells consist of Hek293T cells used at a cell density of 0.4-3.0 x 104 cells/100 ~1 and transfected in the presence of a lipid-based transfection reagent at ratio of transfection reagent to DNA of 6 - 1, in particular at a ratio of 4. Expressed per 10 ml of final transfection mix the amount of transfection reagent is in range of 8.0 - 12.0 ~l and the amount of DNA is in a range of 2.0 - 3.5 ~g. The apoptotic response of the cells in the method according to the invention is determined using art known procedures. In particular using annexin V or nuclear staining. In a preferred embodiment the apoptotic response is determined using Annexin-V- Alexa Fluor 488 and Hoechst 33342. The p75NTR cell death inducing fragment as used hereinbefore comprises the p75 Chopper domain (SEQ ID No.10) and in particular consists of p75_ICD (SEQ ID No.4), p75_CD (SEQ ID No.6) or p75_TNF (SEQ ID No.8).
Procédé d'identification de la capacité d'essai de composés à moduler l'apoptose induite par p75<SP>NTR</SP>, le procédé consistant à: (i) transfecter une suspension de cellules eukaryotes avec un vecteur codant p75<SP>NTR</SP> (SEQ ID No.2) ou une mort cellulaire induisant son fragment, (ii) mettre en contact les cellules avec le composé à tester, et (iii) déterminer la réponse apoptotique de cellules, une altération de la réponse apoptotique en présence du composé à tester par rapport à la réponse apoptotique en l'absence de ce composé indiquant que la capacité du composé d'essai à moduler l'apoptose induite par p75<SP>NTR. </SP>Dans ce procédé, la suspension de cellules eukaryotes implique des cellules Hek293T utilisées à une densité cellulaire de 0,4 et 3,0 x 104 cellules/100 µl et la transfection en présence d'un réactif de transfection à base de lipide selon un rapport de réactif de transfection et d'ADN de 6-1, plus particulièrement un rapport de 4. Exprimée par 10 ml de mélange final de transfection, la quantité de réactif de transfection est comprise entre 8,0 et 12,0 µl et la quantité d'ADN est comprise entre 2,0 et 3,5 µg. La réponse apoptotique des cellules est déterminée par des procédés selon l'état actuel de la technique, plus particulièrement grâce à l'utilisation d'annexine V ou de coloration nucléaire. Dans un mode de réalisation préféré, la réponse apoptotique est déterminée par annexine V-Alexa Fluor 488 et Hoechst 33342. Le fragment induisant la mort cellulaire p75<SP>NTR</SP> comprend le domaine Chopper p75 (SEQ ID No.10) et plus particulièrement p75 ICD (SEQ ID No.4), p75 CD (SEQ ID No.6) ou p75 TNF (SEQ ID No.8).
Bruinzeel Wouter David
Cik Miroslav
Gowling Lafleur Henderson Llp
Janssen Pharmaceutica N.v.
LandOfFree
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