C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01)
Patent
CA 2256457
The invention relates to passive internal references for use in quantitating the formation of amplification products in a nucleic amplification reaction. The internal amplification reference molecules of the invention comprise a first and second fluorophore joined together through a backbone connector. The first and second fluorophores are joined on the backbone in a configuration that permits the energy transfer from the first fluorophore to the second fluorophore. The backbone connector is selected so as not to bind to the target nucleic acid sequence under nucleic acid amplification conditions. Preferably, the backbone connector is a polynucleotide. Another aspect of the invention is to provide passive internal reference molecule containing reagent compositions for use in nucleic acid amplification reactions. The compositions comprise the internal amplification reference molecule of the invention and a nucleic acid amplification reaction buffer. The reagent compositions, optionally, include additional components required for nucleic acid amplification reactions. The invention also provides improved methods of measuring the amount of amplification product in nucleic acid amplification reactions employing fluorescer-quencher probe assays, including methods for the real-time measurement of amplification product formation. The methods comprise the step of adding the internal reference molecule of the invention to the amplification reaction mixture. Fluorescence of the second fluorophore on the internal reference may then be measured and used to calculate changes in fluorescence of the fluorophore on a fluorescer-quencher probe.
La présente invention concerne des référence internes passives destinées à quantifier la formation de produits d'amplification dans une réaction d'amplification nucléique. Les molécules de référence d'amplification de l'invention comprennent un premier fluorophore ainsi qu'un second fluorophore qui sont liés l'un à l'autre par une structure de connexion. Le premier et le second des fluorophores sont reliés à cette structure selon une configuration qui permet un transfert d'énergie du premier fluorophore au second fluorophore. La structure de connexion est choisie de façon qu'elle ne se lie par à la séquence d'acide nucléique cible dans les conditions de l'amplification d'acides nucléiques. La structure de connexion est de préférence un polynucléotide. Sous un autre aspect, l'invention consiste à proposer une molécule de référence interne passive contenant des compositions de réactifs convenant aux réactions d'amplification d'acides nucléiques. Ces compositions sont constituées de la molécule de référence interne passive de l'invention ainsi que d'un tampon de réaction d'amplification d'acides nucléiques. Facultativement, ces compostions de réactifs comprennent des composants supplémentaires nécessaires aux réactions d'amplification d'acides nucléiques. L'invention concerne également un perfectionnement, non seulement des procédés de mesure quantitative du produit d'amplification dans les réactions d'amplification d'acides nucléiques, lesquels procédés font intervenir des techniques de dosage par sondes à fluorescence et extinction, mais également des procédés de mesure en temps réel de la formation des produits d'amplification. Ce procédé consiste à ajouter au mélange de réaction d'amplification la molécule de référence interne passive de l'invention. Il est alors possible de mesurer et d'utiliser la fluorescence du second fluorophore sur la référence interne pour calculer les modifications de fluorescence du fluorophore sur une sonde à fluorescence et extinction.
Livak Kenneth J.
Mcbride Lincoln J.
Applied Biosystems Llc
Perkin-Elmer Corporation The
Sim & Mcburney
LandOfFree
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