Peptide inhibitors of thrombin as potent anticoagulants

Details Peptide inhibitors of thrombin as potent anticoagulants Peptide inhibitors of thrombin as potent anticoagulants

C - Chemistry, Metallurgy

07

K

C07K 14/815 (2006.01) A61K 38/58 (2006.01) A61K 38/00 (2006.01)

Patent

CA 2515798

The tetrapeptide Phe-Asn-Pro-Arg is a structurally-optimized sequence for binding to the active site of thrombin. By conjugating this tetrapeptide or variants thereof to a C-terminal fragment of hirudin, we were able to generate a series of new multivalent inhibitors of thrombin containing only genetically encodable natural amino acids. We found that synergistic binding to both the active site and an exosite of thrombin can be enhanced through substitutions of amino acid residues at the P4, P3 and P3' sites of the active-site directed sequence, Xaa (P4)-Yaa (P3)-Pro (P2)-Arg (P1)-Pro(P1')-Gln(P2')-Zaa(P3'). Complementary to rational design, a phage library was constructed to explore further the residue requirements at the P4, P3 and P3' sites for multivalent and optimized bridge-binding. Panning of the phage library has led to thrombin- inhibitory peptides possessing strong anti-clotting activities in the low nanomolar range and yet interfering only partially with the catalytic active site of thrombin. In all, the availability of potent and genetically-encodable polypeptide inhibitors of thrombin opens the door for much wider applications of this clinically-successful class of anticoagulants, e.g. through more cost- effective recombinant peptide production, in areas such as gene therapy as well as to improve clinical efficacy/safety through the incorporation of homing peptides for targeted delivery.

Le tétrapeptide Phe-Asn-Pro-Arg a une séquence de structure optimale pour la liaison au site actif de la thrombine. La conjugaison de ce tétrapeptide ou de variantes de celui-ci à un fragment C-terminal d'hirudine, a permis de produire une série de nouveaux inhibiteurs plurivalents de thrombine contenant uniquement des acides aminés naturels codables génétiquement. Il a été découvert que la liaison synergique à la fois du site actif et d'un exosite de thrombine peut être améliorée par des substitutions de résidus d'acides aminés au niveau des sites P¿4?, P¿3? et P¿3'? de la séquence dirigée vers le site actif, Xaa (P¿4?)-Yaa (P¿3?)-Pro (P¿2?)-Arg (P¿1?)-Pro(P¿1'?)-Gln(P¿2'?)-Zaa(P¿3'?). De façon complémentaire à la conception rationnelle, une bibliothèque de phages a été élaborée pour explorer les exigences relatives aux résidus au niveau des sites P¿4?, P¿3? et P¿3'? pour liaison pontée plurivalente et optimisée. L'adhérence spécifique de la bibliothèque de phages a conduit à l'obtention de peptides d'inhibition de thrombine ayant des activités d'anticoagulation importantes dans le domaine nanomolaire faible et interférant seulement partiellement avec le site catalytique actif de la thrombine. En tout, la disponibilité des inhibiteurs polypeptidiques de thrombine, codables génétiquement et puissants, ouvre la porte à de plus vastes applications de cette catégorie d'anticoagulants utiles d'une point de vue clinique, par ex. par production de peptides recombinés plus économique, dans des domaines tels que la thérapie génique, ainsi que pour améliorer l'efficacité/la sécurité clinique par incorporation de peptides de localisation pour administration ciblée.

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