C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C07H 21/00 (2006.01)
Patent
CA 2268371
The invention relates to novel chimeric phosphoramidate oligonucleotides and their use in primer-extension methods such as DNA sequencing and nucleic acid amplification. The subject chimeric phosphoramidate oligonucleotides have both N3'-phosphoramidate linkages and phosphodiester linkages. The invention includes methods of primer extension using the subject chimeric oligonucleotides as primers. Primer extension methods of interest include nucleic acid amplification reactions, e.g. PCR, and polynucleotide sequencing reactions. In the primer extension methods of the invention, a chimeric phosphoramidate oligonucleotide primer is annealed to a polynucleotide template. After annealing, the chimeric oligonucleotide primer is extended by joining a nucleotide to the 3' end of the primer by a DNA polymerase catalyzed reaction. Other embodiments of the invention include methods of primer extension using phosphoramidate linkage containing polynucleotide templates. Such methods include annealing an oligonucleotide primer (chimeric or otherwise) to a polynucleotide template comprising at least one phosphoramidate linkage. Nucleotides are added to the primer in a DNA polymerase catalyzed reaction. Primer extension takes place across one or more of the phosphoramidate linkages in the template. The invention includes compositions comprising a chimeric phosphoramidate oligonucleotide of the invention and a divalent cation. Divalent cations serve to increase the binding affinity between the chimeric oligonucleotides of the invention and a polynucleotide template. Additionally, divalent cations may be used to stabilize the phosphoramidate linkages of the subject chimeric oligonucleotides against hydrolysis at elevated temperatures, such as the temperatures used in PCR and cycle sequencing. The subject compositions may further comprise a thermostable DNA polymerase such as Taq DNA polymerase.
Cette invention concerne de nouveaux oligonucléotides de phosphoramidates chimériques ainsi que leur utilisation dans des procédés d'allongement d'amorces tels que le séquençage de l'ADN et l'amplification d'acides nucléiques. Les oligonucléotides de phosphoramidate chimériques de cette invention présentent à la fois des liaisons N3'-phosphoramidate et des liaisons phosphodiester. On décrit des procédés d'allongement d'amorces dans lesquels on utilise en tant qu'amorces les oligonucléotides chimériques de cette invention. Les procédés d'allongement d'amorce étudiés comprennent les réactions d'amplification d'acides nucléiques, par exemple la PCR, et les réactions de séquençage polynucléotidique. Dans les procédés d'allongement d'amorce de cette invention, une amorce oligonucléotique de phosphoramidate chimérique est annelée à une matrice polynucléotidique. Après l'annelage, l'amorce oligonucléotidique chimérique est allongée au moyen de la liaison d'un nucléotide à l'extrémité 3' de l'amorce au moyen d'une réaction catalysée par l'ADN polymérase. D'autres formes de réalisation de l'invention comprennent des procédés d'allongement d'amorces dans lesquels on utilise une liaison phosphoramidate contenant des matrices polynucléotidiques. Ces procédés comprennent l'annelage d'une amorce oligonucléotidique (chimérique ou autre) à une matrice polynucléotidique comprenant au moins une liaison phosphoramidate. Des nucléotides sont ajoutés à l'amorce dans la réaction catalysée par ADN polymérase. L'extension d'amorce s'effectue au niveau d'une ou de plusieurs liaisons phosphoramidate dans la matrice. Cette invention concerne des compositions contenant un oligonucléotide de phosphoramidate chimérique de cette invention et un cation bivalent. Les cations bivalents servent à accroître l'affinité de liaison entre les oligonucléotides chimériques de cette invention et une matrice polynucléotidique. En outre les cations bivalents peuvent être utilisés pour stabiliser les liaisons phosphoramidate des oligonucléotides chimériques de cette invention contre des hydrolyses à des températures élevées, telles que les températures utilisées dans la PCR et le séquençage des cycles. Les compositions de cette invention peuvent également contenir un ADN polymérase thermostable tel qu'un ADN polymérase Taq.
Ellis Nicole M.
Heiner Cheryl R.
Kuimelis Robert G.
Lazaruk Katherine D.
Walsh Patric Sean
Applera Corporation
Perkin-Elmer Corporation The
Sim & Mcburney
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1908075