C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/09 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01)
Patent
CA 2738557
A process of inserting a nucleic acid sequence of interest into an acceptor nucleic acid, comprising the following steps: amplifying by PCR a DNA comprising in the following order a sequence segment U, a nucleic acid sequence segment of known nucleotide sequence K2 and a nucleic acid sequence segment of known sequence K3 using a forward primer defining a first end of the amplified DNA and a reverse primer defining a second end of the amplified DNA, said reverse primer terminating at its 3'-end in a nucleotide sequence of nucleic acid sequence segment K3; treating the linear double-stranded DNA molecules contained in the PCR product obtained in the previous step with an exonuclease to obtain a single-stranded over-hang at the first end of the DNA and a single-stranded overhang comprising nucleic acid segments K2 and K3 at the second end of the DNA; and annealing the product of the previous step to a linearized double-stranded acceptor nucleic acid having at a first end thereof a single-stranded overhang complementary to the single-stranded over-hang of the first end of the DNA and at a second end thereof a single- stranded overhang complementary to the single-stranded sequence segment K2 of the second end of the DNA.
Le procédé ci-décrit permettant d'insérer une séquence d'acides nucléiques d'intérêt dans un acide nucléique accepteur comprend les étapes suivantes : amplification par PCR d'un fragment d'ADN comprenant, dans l'ordre suivant, un segment de séquence U, un segment de séquence d'acide nucléique ayant une séquence de nucléotides K2 connue et un segment de séquence d'acide nucléique ayant une séquence de nucléotides K3 connue, au moyen d'une amorce sens définissant une première extrémité du fragment d'ADN amplifié et d'une amorce antisens définissant une seconde extrémité du fragment d'ADN amplifié, ladite amorce antisens se terminant en son extrémité 3' par une séquence de nucléotides correspondant au segment de séquence d'acide nucléique K3; traitement des molécules ADN double brin linéaires contenues dans le produit de PCR obtenu à l'étape précédente avec une exonucléase pour obtenir une extrémité sortante simple brin à la première extrémité de l'ADN et une extrémité sortante simple brin comprenant les segments d'acides nucléiques K2 et K3 à la seconde extrémité de l'ADN; et annelage du produit de l'étape précédente pour obtenir un acide nucléique accepteur double brin linéarisé ayant à sa première extrémité une extrémité sortante simple brin complémentaire de l'extrémité sortante simple brin de la première extrémité de l'ADN et à sa seconde extrémité, une extrémité sortante simple brin complémentaire du segment de séquence simple brin K2 de la seconde extrémité de l'ADN.
Engler Carola
Kandzia Romy
Marillonnet Sylvestre
Thieme Frank
Weber Ernst
Icon Genetics Gmbh
Smart & Biggar
LandOfFree
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