C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/10 (2006.01) A61K 31/711 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) C12N 15/85 (2006.01)
Patent
CA 2345936
Methods and compositions for producing single-stranded cDNA (ss-cDNA) in eukaryotic cells, specifically, a DNA cassette that produces ss-cDNA in vivo. The cassette contains the Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase/RNAse H coding gene, a bacterial restriction endonuclease gene, and a sequence of interest which produces an RNA template from which the reverse transcriptase synthesizes ss-cDNA of a specified sequence. The ss-cDNA is then modified to remove all flanking vector sequences by taking advantage of the "stem-loop" structure of the ss-cDNA, which forms as a result of the inclusion of an inverted tandem repeat that allows the ss-cDNA to fold back on itself, forming a double stranded DNA stem, in the sequence of interest. The double-stranded stem contains one or more functional genetic elements such as a restriction endonuclease recognition site and the loop, which remains as ss- DNA, is comprised of any desired nucleotide sequence. This design allows the double-stranded stem of the stem-loop intermediate to be cleaved by the desired corresponding restriction endonuclease(s) specific for the site in the stem and the loop portion, or sequence of interest, is then relased as a linearized, single-stranded piece of DNA. This released (or cleaved) ss-DNA piece contains minimal, if any, sequence information either upstream 5' or downstream 3' from the previous double stranded stem portion which contains the restriction endonuclease cut site. In vivo tranfections using the DNA vector system described herein demonstrate the use of this system to produce ss-DNA in host cells.
L'invention concerne des méthodes et compositions de production d'ADN complémentaire simple brin dans des cellules eucaryotes et plus particulièrement une cassette d'ADN produisant un ADN complémentaire simple brin in vivo. La cassette contient le gène codant une transcriptase inverse du virus de leucémie murine de Moloney/ribonucléase H, un gène endonucléase de restriction bactérienne et une séquence intéressante produisant une matrice d'ARN à partir de laquelle la transcriptase inverse synthétise un ADN complémentaire simple brin d'une séquence particulière. On modifie ensuite l'ADN complémentaire simple brin pour retirer toutes les séquences de vecteurs flanquantes en profitant de la structure </= souche-boucle >/= de l'ADN complémentaire simple brin qui se forme suite à l'inclusion d'une répétition en tandem inversée qui permet à l'ADN complémentaire simple brin de se replier pour former une souche d'ADN double brin dans la séquence intéressante. La souche double brin contient un ou plusieurs éléments génétiques fonctionnels tels qu'un site de reconnaissance d'endonucléase de restriction et la boucle, qui reste comme un ADN complémentaire simple brin, est composée de n'importe quelle séquence nucléotidique voulue. Cette configuration permet à la souche double brin de la souche-boucle intermédiaire d'être clivée par l'endonucléase ou les endonucléases de restriction correspondants spécifiques du site dans la souche, et la boucle, ou séquence intéressante, est ensuite libérée comme une partie d'ADN linéaire, simple brin. Cette partie d'ADN simple brin libérée (ou clivée) contient des informations de séquences minimales, s'il en est, en amont à 5' ou en aval à 3' à partir de la souche double brin antérieure qui contient le site de coupure d'endonucléase de restriction. L'utilisation de ce système pour produire de l'ADN simple brin dans des cellules hôtes est illustrée par les transfections in vivo réalisées grâce au système vectoriel d'ADN selon l'invention.
Chen Yin
Conrad Charles A.
Cytogenix Inc.
Gowling Lafleur Henderson Llp
Ingene Inc.
LandOfFree
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