C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/37 (2006.01) G01N 33/58 (2006.01)
Patent
CA 2283434
Heterogenous and homogenous assays are provided for the detection of protease inhibitory activity in a sample or target compound, taking advantage of the chemiluminescent characteristics of 1,2-dioxetanes. In the heterogenous assay, a peptide bearing a cleavage site for the protease of interest is provided with a first member of a first ligand binding pair at one end, and a first member of a second ligand binding pair at the other end. The other member of the first ligand binding pair is attached to a surface, which binds the peptide, or protease substrate, to the surface. The peptide substrate is combined with the protease and target compound or sample. Substrate cleavage, if not inhibited, is allowed to occur, and any unbound cleaved fragments are removed. An enzyme complexed with the second member of the second ligand binding pair is added, and allowed to bind to any of the (uncleaved) first member of the second ligand binding pair remaining. Unbound complex is removed, and a 1,2-dioxetane substrate for the enzyme is added. If any peptide substrate has not been cleaved, the dioxetane will chemiluminesce, indicating inhibitory activity. In a homogenous assay, the same substrate bears at one end a fluorescent energy accepting moiety, and at the other end a 1,2- dioxetane or precursor. If the substrate is cleaved by the protease, the dioxetane and the fluorescent moiety are not in close physical relationship, and no energy transfer occurs when the dioxetane is caused to decompose. If cleavage has not occurred, indicating inhibition, when the dioxetane is caused to decompose, energy is transferred to the fluorescing entity, which releases light of a wavelength recognizably distinct from that of the dioxetane.
La présente invention concerne des essais hétérogènes et homogènes visant à la détection d'une activité inhibitrice de protéase dans un échantillon ou un composé cible, en profitant des caractéristiques de chimioluminescence des 1,2-dioxétanes. En essai hétérogène, un peptide portant un site de clivage pour la protéase à étudier est pourvu, à l'une des extrémités, d'un premier élément d'une première paire de liaison de ligands, et à l'autre extrémité, d'un premier élément d'une deuxième paire de liaison de ligands. L'autre élément de la première paire de liaison de ligands est attaché à une surface, liant ainsi le peptide, ou au substrat de protéase, ce qui lie la surface. Le substrat de peptide est combiné avec la protéase et le composé cible ou l'échantillon. Le clivage de substrat, lorsqu'il n'est pas inhibé, est amené à se produire, tout fragment clivé non lié étant supprimé. Un enzyme complexé au moyen du deuxième élément de la deuxième paire de liaison de ligands est ajouté puis amené à se lier au premier élément (non clivé) de la deuxième paire restante de liaison de ligands. Le complexe non lié est supprimé et un substrat 1,2-dioxétane destiné à l'enzyme est ajouté. Si l'un des substrats de peptide n'a pas été clivé, le dioxétane deviendra chimioluminescente, témoignant d'une activité inhibitrice. En essai homogène, le même substrat porte à une extrémité un groupe fonctionnel acceptant l'énergie de fluorescence, et à l'autre extrémité un 1,2-dioxétane ou un précurseur. Si le substrat est clivé par la protéase, le dioxétane et le groupe fonctionnel fluorescent ne sont pas en étroite relation physique, et aucun transfert d'énergie ne se produit lorsque le dioxétane est amené à se décomposer. Si le clivage n'a pas eu lieu, témoignant ainsi d'une inhibition, lorsque le dioxétane est amené à se décomposer, il y a transfert d'énergie à l'entité fluorescente, ce qui libère de la lumière d'une longueur d'ondes se distinguant visiblement de celle du dioxétane.
Bronstein Irena
Palmer Michelle
Tillotson Bonnie
Voyta John
Ogilvy Renault Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
Tropix Inc.
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1861225