C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/25 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) G01N 33/542 (2006.01) G01N 33/573 (2006.01) G01N 33/58 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01)
Patent
CA 2196496
We describe a strategy for designing protein-fragment complementation assays to detect protein-protein interactions in vivo. The design and implementation of this strategy is illustrated with the enzyme murine dihydrofolate reductase (DHFR). Fusion peptides consisting of N- and C-terminal fragments of murine DHFR fused to GCN4 leucine zipper sequences were coexpressed in Escherichia coli grown in minimal medium, where the endogenous DHFR activity was inhibited with trimethoprim. Coexpression of the complementary fusion products restored colony formation. Survival only occurred when both DHFR fragments were present and contained leucine-zipper forming sequences, demonstrating that reconstitution of enzyme activity requires assistance of leucine zipper formation. DHFR fragment-interface point mutants of increasing severity (Ile to Val, Ala and Gly) resulted in a sequential increase in E. coli doubling timesillustrating the successful DHFR fragment reassembly rather than non-specific interactions between fragments. This in vivo assay could be used to study equilibrium and kinetic aspects of protein-protein interactions and forscreening cDNA libraries for binding of a target protein with unknown proteins. Further, the selection and design criteria applied here to DHFR could be used to develop a strategy using any enzyme that would be appropriate for a clonal selection or direct detection of enzyme activity.
Nous décrivons une stratégie pour l'élaboration d'épreuves de complémentation de fragments de protéines visant à détecter les interactions entre protéines in vivo. La conception et l'application de cette stratégie sont illustrées avec l'enzyme dihydrofolate réductase (DHFR) de souris. Les peptides de fusion constitués de fragments des extrémités C et N terminales de la DHFR de souris fusionnés aux motifs de type fermeture éclair à leucines du GCN4 ont été coexprimés dans Escherichia coli cultivé dans un milieu minimal, dans lequel l'activité de la DHFR endogène a été inhibée par le triméthoprime. La coexpression des produits de fusion complémentaires a restauré la formation de colonies. Il n'y a eu survie qu'en présence des deux fragments de DHFR contenant les motifs de type à fermeture éclair à leucines, ce qui démontre que la reconstitution de l'activité enzymatique requiert les motifs de type fermeture éclair à leucines. Des mutations ponctuelles à l'interface d'assemblage des fragments de DHFR d'importance croissante (Ile à Val, Ala ou Gly) ont entraîné une augmentation séquentielle du temps de doublement de E. coli, illustrant la réussite du rassemblement des fragments de DHFR plutôt que des interactions non spécifiques entre les fragments. Cette épreuve in vivo pourrait être utilisée pour étudier l'équilibre et les aspects cinétiques des interactions entre les protéines et pour sélectionner des banques d'ADNc qui serviront à la liaison d'une protéine cible à des protéines inconnues. En outre, les critères de sélection et de conception appliqués ici à la DHFR pourraient servir à l'élaboration d'une stratégie recourant à n'importe quelle enzyme qui serait appropriée pour une sélection clonale ou une détection directe de l'activité enzymatique.
Goudreau Gage Dubuc
Michnick Stephen William Watson
Universite de Montreal
LandOfFree
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