C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/12 (2006.01) C07K 1/113 (2006.01) C07K 1/22 (2006.01) C07K 14/47 (2006.01) C12Q 1/02 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2218456
The present invention describes methods of producing milligram quantities of three forms of puriried Statl protein from recombinant DNA constructs. In addition, the Stat proteins may be isolated in their phosphorylated or nonphosphorylated forms (Tyr 701). The proteins can be produced in baculovirus infected insect cells, or E. coli. A compact domain in the amino terminus of Stat .alpha. was isolated and found to enhance DNA binding due to its abiliry to interact with a neighboring Stat protein. A relatively protease-resistant recombinant truncated form of the Stat protein was isolated in 40-50 mg quantities. Purification of the Stat proteins were performed after modifying specific cysteine residues of the Stat proteins to prevent aggregation. Activated EGF-receptor partially purified from membranes by immunoprecipitation was shown to be capable of in virro catalysis of the phosphorylation of the tyrosine residue of Statl known to be phosphorylated in vivo. Techniques are enclosed to separate the phosphorylated from the nonphosphorylated Stat proteins. The techniques disclosed are general for Stat proteins and may be used to isolate large quantities of purified Stat 2, 3, 4, 5A, 5B and 6. Methods for using purified Stat proteins, truncated Stat proteins, or Stat N-terminal fragments for drug discovery are also disclosed.
L'invention porte sur des méthodes pour produire des quantités de l'orde du milligramme, de trois formes de protéines Stat purifiées à partir d'ADN synthétique recombinant. De plus, les protéines Stat peuvent être isolées sous leurs formes phosphorylées ou non phosphorylées (Tyr 701). Les protéines peuvent être produites dans des cellules d'insectes infectés par le baculovirus, ou par E. coli. Un domaine compact dans l'extrémité aminée de Stat-alpha a été isolé; il possédait un pouvoir de fixation amélioré à l'ADN en raison de sa capacité d'interaction avec une protéine Stat voisine. Une forme tronquée recombinante relativement résistante à la protéase a été isolée dans des quantités de 40-50 mg de produit. La purification des protéines Stat a été effectuée après modification de résidus spécifiques de cystéine des protéines Stat pour empêcher l'agrégation. Un récepteur de l'EGF activé et partiellement purifié, obtenu à partir de membranes par immunoprécipitation, s'est révélé apte à catalyser la phosphorylation du résidu de tyrosine de la Stat phosphorylée in vivo. Des techniques sont divulguées pour séparer les protéines Stat phosphorylées des protéines Stat non phosphorylées. Il s'agit de techniques générales pour les protéines Stat, qui peuvent servir à isoler de grandes quantités de Stat 2, 3, 4, 5A, 5B 6 purifiées. Divulgation de méthodes pour utiliser des protéines Stat purifiées, des protéines Stat tronquées ou des fragments Stat à N terminal, pour la recherche sur des médicaments.
Darnell James E. Jr.
Vinkemeier Uwe
Ogilvy Renault Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
The Rockefeller University
LandOfFree
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