C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2395391
A novel method of pyrophosphorolysis activated polymerization (PAP) has been developed. In PAP, pyrophosphorolysis and polymerization by DNA polymerase are coupled serially for each amplification by using an activatable oligonucleotide P* that has a non-extendable 3'-deoxynucleotide at its 3' terminus. PAP can be applied for exponential amplification or for linear amplification. PAP can be applied to amplification of a rare allele in admixture with one or more wild type alleles by using an activatable oligonucleotide P* that is an exact match at its 3' end for the rare allele but has a mismatch at or near its 3' terminus for the wild type allele. PAP is inhibited by a mismatch in the 3' specific subsequence as far as 16 nucleotides away from the 3' terminus. PAP can greatly increase the specificity of detection of an extremely rare mutant allele in the presence of the wild type allele. Specificity results from both pyrophosphorolysis and polymerization since significant nonspecific amplification requires the combination of mismatch pyrophosphorolysis and misincorporation by the DNA polymerase, an extremely rare event. Using genetically engineered DNA polymerases greatly improves the efficiency of PAP.
L'invention concerne un nouveau procédé de polymérisation activée par pyrophosphorolyse (PAP). Dans la PAP, la pyrophosphorolyse et la polymérisation par l'ADN polymérase sont couplées en série pour chaque amplification, grâce à l'utilisation d'un oligonucléotide P* activable possédant un 3'-désoxynucléotide non extensible à son extrémité 3'. On peut appliquer la PAP en vue d'une amplification exponentielle ou linéaire. La PAP peut s'appliquer à l'amplification d'un allèle rare dans une admixtion avec au moins un type d'allèle sauvage par l'utilisation d'un oligonucléotide P* activable qui à son extrémité 3' correspond exactement à l'allèle rare mais présentant un mésappariement au niveau de son extrémité 3', ou près de celle-ci, pour l'allèle de type sauvage. La PAP est inhibée par un mésappariement de la sous séquence spécifique 3' située jusqu'à 16 nucléotides de l'extrémité 3'. La PAP peut augmenter considérablement la spécificité de détection d'un allèle mutant extrêmement rare en présence de l'allèle de type sauvage. La spécificité résulte aussi bien de la pyrophosphorolyse que de la polymérisation, puisque une amplification non spécifique importante requiert la combinaison de pyrophosphorolyse non appariée et une mauvaise incorporation par l'ADN polymérase, ce qui est extrêmement rare. L'utilisation d'ADN polymérases génétiquement modifiées améliore considérablement l'efficacité de la PAP.
Liu Qiang
Sommer Steve S.
City Of Hope
Osler Hoskin & Harcourt Llp
LandOfFree
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