C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C07K 14/82 (2006.01)
Patent
CA 2205392
There is disclosed a quantitative sensitive method to enable the detection of point mutations at a known site and a diagnostic kit which uses a multi step (for example, four steps) or a single step reaction. The method uses selective polymerase chain reaction (PCR) amplification of mutant test gene sequences involving first stage amplification of both mutant and wild-type sequences, first stage restriction enzyme digestion of only wild-type sequences, second stage amplification of undigested amplified fragments enriched in mutant sequences and second stage digestion of previously undigested wild-type sequences. Long and short tail primers are used in the first and second stages of amplification respectively to enable selective amplification (in the second stage) of only previously amplified material and none of the original test genomic DNA. The short tail primers are labelled with biotin and fluorescence at their respective 5' and 3' ends to enable easy detection and quantitation of mutations in the test gene via automated fluorescence readers. The use of multi steps as well as a single step reaction is disclosed. The process is exemplified with respect to its use in detecting mutations in the human K- <u>ras</u> gene, yet it is applicable for any given mutation in a defined site.
L'invention concerne un procédé quantitatif sensible permettant la détection de mutations ponctuelles au niveau d'un site connu, ainsi qu'une trousse de diagnostic faisant appel à une réaction à phases multiples (quatre phases par exemple) ou à une seule phase. Ledit procédé a recours à l'amplification sélective par réaction en chaîne de la polymérase (ACP) de séquences de gènes mutants de test, comprenant une première phase d'amplification de séquences de mutants et de type sauvage, une première phase de digestion par des enzymes de restriction de séquences uniquement de type sauvage, une seconde phase d'amplification de fragments amplifiés non digérés, enrichis avec des séquences de mutants, et une seconde phase de digestion de séquences de type sauvage non digérées. Des amorces à queues longues et courtes sont utilisées dans la première et la seconde phase d'amplification, afin de permettre l'amplification sélective (dans la seconde phase) uniquement du matériel amplifié auparavant et non celle de l'ADN génomique original de test. Les amorces à queues courtes sont marquées avec de la biotine et par fluorescence au niveau de leurs extrémités respectives 5' et 3', ce qui facilite la détection et la quantification de mutations dans le gène de test par des systèmes automatiques de lecture de marqueurs fluorescents. L'invention concerne également l'utilisation de réactions à phases multiples et à phase unique. Le procédé peut être utilisé pour la détection de mutations dans le gène humain K-<u>ras</u>, mais il est également applicable à toute mutation donnée au niveau d'un site défini.
American Health Foundation
Marks & Clerk
LandOfFree
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