C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2649725
The present invention provides methods for determining a nucleic acid sequence by performing successive cycles of duplex extension along a single stranded template. The cycles comprise steps of extension, ligation, and, preferably, cleavage. In certain embodiments the methods make use of extension probes containing phosphorothiolate linkages and employ agents appropriate to cleave such linkages. In certain embodiments the methods make use of extension probes containing an abasic residue or a damaged base and employ agents appropriate to cleave linkages between a nucleoside and an abasic residue and/or agents appropriate to remove a damaged base from a nucleic acid. The invention provides methods of determining information about a sequence using at least two distinguishably labeled probe families. In certain embodiments the methods acquire less than 2 bits of information from each of a plurality of nucleotides in the template in each cycle. In certain embodiments the sequencing reactions are performed on templates attached to microparticles, which are immobilized in or on a semi-solid support or attached to a substrate. The invention further provides sets of labeled extension probes containing phosphorothiolate linkages or trigger residues that are suitable for use in the method. In addition, the invention includes performing multiple sequencing reactions on a single template by removing initializing oligonucleotides and extended strands and performing subsequent reactions using different initializing oligonucleotides. The invention further provides efficient methods for preparing templates, particularly for performing sequencing multiple different templates in parallel. The invention also provides methods for performing ligation and cleavage. The invention also provides new libraries of nucleic acid fragments containing paired tags, and methods of preparing microparticles having multiple different templates (e.g., containing paired tags) attached thereto and of sequencing the templates individually. The invention also provides automated sequencing systems, flow cells, image processing methods, and computer-readable media that store computer-executable instructions (e.g., to perform the image-processing methods) and/or sequence information. In certain embodiments the sequence information is stored in a database. The invention further provides blocking oligonucleotides and methods of use thereof to facilitate sequencing. Further provided are arrays comprising microparticles having templates attached thereto and attached to a substrate in the absence of a semi-solid medium and methods of sequencing the templates. The invention also provides arrays of nucleic acid colonies produced using microparticles to "imprint" templates on a semi-solid medium or substrate, and methods of sequencing thereof.
La présente invention concerne des procédés permettant de déterminer une séquence d'acides nucléiques au moyen de cycles successifs d'extension de double hélice sur une matrice à simple brin. Les cycles comprennent des étapes d'extension, de ligature et, de préférence, de clivage. Dans certains modes de réalisation, les procédés mettent en oeuvre des sondes d'extension qui contiennent des liaisons phosphorothiolate et utilisent des agents adaptés au clivage de telles liaisons. Dans certains modes de réalisation, les procédés mettent en oeuvre des sondes d'extension qui contiennent un résidu abasique ou une base endommagée et utilisent des agents adaptés au clivage de liaisons entre un nucléoside et un résidu abasique et/ou des agents adaptés au retrait d'une base endommagée d'un acide nucléique. Cette invention concerne des procédés permettant de déterminer des informations concernant une séquence au moyen d'au moins deux familles de sondes marquées de façon reconnaissable. Dans certains modes de réalisation, les procédés permettent d'obtenir moins de 2 bits d'informations de chacun des nucléotides dans la matrice au cours de chaque cycle. Dans certains modes de réalisation, les réactions de séquençage sont réalisées sur des matrices reliées à des microparticules qui sont immobilisées dans ou sur un support semi-solide ou reliées à un substrat. Cette invention concerne également des ensembles de sondes d'extension marquées qui contiennent des liaisons phosphorothiolate ou des résidus de déclenchement adaptés à une utilisation dans le cadre dudit procédé. De plus, cette invention consiste à mettre en oeuvre de multiples réactions de séquençage sur une matrice unique par retrait d'oligonucléotides d'initialisation et de brins étendus, puis à mettre en oeuvre des réactions ultérieures au moyen d'oligonucléotides d'initialisation différents. Ladite invention concerne aussi des procédés permettant de préparer des matrices, notamment permettant de mettre en oeuvre en parallèle un séquençage de plusieurs matrices différentes. Elle concerne également des procédés permettant d'effectuer une ligature et un clivage. Cette invention concerne aussi de nouvelles bibliothèques de fragments d'acide nucléique contenant des étiquettes appariées, ainsi que des procédés permettant de préparer des microparticules auxquelles sont reliées plusieurs matrices différentes (par ex. contenant des étiquettes appariées) et de séquencer les matrices individuellement. Cette invention concerne également des systèmes de séquençage automatisé, des cuves à circulation, des procédés de traitement d'image et des supports lisibles sur ordinateur qui enregistrent des instructions exécutables sur ordinateur (par ex. pour mettre en oeuvre les procédés de traitement d'image) et/ou des informations de séquence. Dans certains modes de réalisation, les informations de séquence sont enregistrées dans une base de données. Ladite invention concerne aussi des oligonucléotides de blocage et des procédés pour les utiliser afin de faciliter le séquençage. Elle concerne également des réseaux comprenant des microparticules auxquelles sont reliées des matrices et qui sont reliées à un substrat en l'absence d'un support semi-solide, ainsi que des procédés de séquençage des matrices. En outre, cette invention concerne des réseaux de colonies d'acides nucléiques produites au moyen desdites microparticules afin de laisser l'empreinte de matrices sur un support semi-solide ou un substrat, ainsi que des procédés de séquençage de ceux-ci.
Blanchard Alan
Costa Gina
Mckernan Kevin
Applera Corporation
Applied Biosystems Llc
Sim & Mcburney
LandOfFree
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