C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/57 (2006.01) A61K 39/08 (2006.01) C12N 1/19 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 9/00 (2006.01) C12N 9/52 (2006.01) C12N 15/31 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01)
Patent
CA 2428270
Botulinum neurotoxins, the most potent of all toxins, induce lethal neuromuscular paralysis by inhibiting exocytosis at the neuromuscular junction. The light chains (LC) of these dichain neurotoxins are a new class of zinc-endopeptidases that specifically cleave the synaptosomal proteins, SNAP-25, VAMP, or syntaxin at discrete sites. The present invention relates to the construction, expression, purification, and use of synthetic or recombinant botulinum neutoroxin genes. For example, a synthetic gene for the LC of the botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) was constructed and overexpressed in Escherichia coli. The gene product was purified from inclusion bodies. The methods of the invention can provide 1.1 g of the LC per liter of culture. The LC product was stable in solution at 4 ~C for at least 6 months. This rBoNT/A LC was proteolytically active, specifically cleaving the Glu-Arg bond in a 17-residue synthetic peptide of SNAP-25, the reported cleavage site of BoNT/A. Its calculated catalytic efficiency kcat/Km was higher than that reported for the native BoNT/A dichain. Treating the rBoNT/A LC with mercuric compounds completely abolished its activity, most probably by modifying the cysteine-164 residue located in the vicinity of the active site. About 70 % activity of the LC was restored by adding Zn2+-free, apo-LC preparation. The LC was nontoxic to mice and failed to elicit neutralizing epitope(s) when the animals were vaccinated with this protein. In addition, injecting rBoNT/A LC into sea urchin eggs inhibited exocytosis-dependent plasma membrane resealing.
Les neurotoxines de botulinum, les plus puissantes des toxines, induisent la paralysie neuromusculaire létale en inhibant l'exocytose au niveau de la jonction neuromusculaire. Les chaînes légères (CL) desdites neurotoxines à deux chaînes constituent une nouvelle classe d'endopeptidase à zinc qui coupent spécifiquement les protéines synaptiques, SNAP-25, VAMP, ou la syntaxine au niveau de sites séparés. L'invention concerne la construction, l'expression, la purification et l'utilisation de gènes de neurotoxines de botulinum de recombinaison. Par exemple, un gène synthétique pour la CL du sérotype A des neurotoxines de botulinum (BoNT/A) a été construit et surexprimé dans escherichia coli. Le produit génique a été purifié, de sorte qu'il soit débarrassé des corps d'inclusion. Les procédés de l'invention peuvent permettre la production de 1,1 g de LC par litre de milieu de culture. Le produit CL est stable en solution à 4 ·C pendant au moins 6 mois. Ladite LC de rBoNT/A est active au plan protéolytique en coupant spécifiquement la liaison Glu-Arg dans un peptide synthétique à 17 résidus, de SNAP-25, le site de coupure recensé de BoNT/A. Son efficacité catalytique calculée k¿cat?/K¿m? est supérieure à celle recensée pour la chaîne double de BoNT/A. Le traitement de la LC de rBoNT/A au moyen de composés mercuriques supprime totalement son activité, très probablement par la modification du résidu 164 de cystéine, situé à proximité du site actif. Environ 70 % de l'activité de CL est rétablie par l'addition de Zn?2+¿ à une préparation apo-CL, exempte de Zn?2+¿. La CL est non toxique pour les souris et ne parvient pas à éliciter le(s) épitope(s) neutralisants lorsque les animaux ont été vaccinés avec cette protéine. De plus, l'injection de CL de rBoNT/A dans des oeufs d'oursins induit l'inhibition de la refermeture de la membrane plasmique dépendant de l'exocytose.
Jensen Melody
Smith Leonard A.
Bereskin & Parr Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Army
LandOfFree
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