C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01)
Patent
CA 2503247
The present invention provides methods and compositions for rapid high capacity functional screening to identify optimal pre-trans-splicing molecules (PTMs). The compositions of the invention include PTM expression libraries capable of encoding candidate PTMs designed to interact with a target precursor messenger RNA molecule (target pre-mRNA) and mediate a trans- splicing reaction resulting in the generation of a novel chimeric RNA molecule (chimeric RNA). The candidate PTMs of the invention encode a portion of a first reporter molecule and may encode one or more other reporter molecules, which can be used to select for cells expressing optimal PTMs (efficient and specific). The compositions of the invention also include cells that express a target pre-mRNA encoding the remaining portion of the first reporter molecule. The screening methods of the invention encompass (i) contacting a PTM expression library with cells expressing a target pre-mRNA under conditions in which a trans-splicing reaction will occur in the presence of an optimal PTM (expressed by the library vector) resulting in the formation of a chimeric repaired RNA molecule capable of encoding at least one reporter molecule; (ii) selecting for cells expressing the repaired reporter molecule wherein expression of the reporter molecule indicates the presence of an optimal PTM in the selected cell; and (iii) identifying the optimal PTM expressed in the selected cell(s). The additional reporter molecule(s) can be used to assess both specific and non-specific trans-splicing, as well direct PTM expression.
La présente invention se rapporte à des procédés et à des compositions permettant un criblage fonctionnel haute capacité rapide, destiné à identifier des molécules de pré-trans-épissage (PTM) optimales. Les compositions selon l'invention contiennent des banques d'expression de PTM pouvant coder des PTM candidates conçues pour interagir avec un précurseur d'ARN messager cible (pré-ARNm cible) et servir d'intermédiaire dans une réaction de trans-épissage, ce qui permet la génération d'une nouvelle molécule d'ARN chimère (ARN chimère). Les PTM candidates selon l'invention codent une partie d'un premier ligand et peuvent coder un ou plusieurs autres ligands, qui peuvent servir à sélectionner des cellules exprimant des PTM optimales (efficaces et spécifiques). Les compositions selon l'invention contiennent également des cellules qui expriment un pré-ARNm cible codant la partie restante du premier ligand. Les procédés de criblage selon l'invention consistent : (i) à mettre une banque d'expression de PTM en contact avec des cellules exprimant un pré-ARNm cible, dans des conditions permettant à une réaction de trans-épissage d'intervenir en présence d'une PTM optimale (exprimée par le vecteur de la banque), ce qui entraînera la formation d'une molécule d'ARN réparée chimère, laquelle peut coder au moins un ligand ; (ii) à sélectionner des cellules exprimant le ligand réparé, l'expression dudit ligand indiquant la présence d'une PTM optimale dans la cellule sélectionnée ; et (iii) à identifier la PTM optimale exprimée dans la ou les cellules sélectionnées. Le ou les ligands supplémentaires peuvent servir à évaluer le trans-épissage tant spécifique que non spécifique, ainsi que l'expression de PTM directe.
Garcia-Blanco Mariano
Mitchell Lloyd G.
Otto Edward
Puttaraju Madaiah
Yang Yanping
Bereskin & Parr Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
Intronn Inc.
Virxsys Corporation
LandOfFree
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