G - Physics – 06 – F
Patent
G - Physics
06
F
G06F 17/00 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01)
Patent
CA 2447612
Nucleic acid hybridization under steady-state conditions is described by a kinetic model in which the intermediate state is assumed to be locally single stranded. An expression was derived that relates nucleic acid secondary structure to the rate of oligonucleotide-RNA hybridization. The model assumes that the hybridization of nucleic acids occurs through an intermediate state in which the region to be hybridized has a single-stranded conformation prior to binding the antisense oligonucleotide. In the derivation, a steady-state condition is assumed. The model is applicable to the steady-state condition in living cells and the initial stage of single-tube hybridization when full- length hybrid has not significantly accumulated and the concentration of nucleation complex is approximately constant. The model allows the calculation of a rate factor that is proportional to the rate constant for hybridization between complementary nucleic acids. When rate factors were calculated using a commercially available algorithm for estimating RNA secondary structure, they correlated well with rates for hybridization of antisense oligodeoxynucleotides (ODNs) to a 101-nucleotide artificial RNA that has been published and of molecular beacons to HIV-1 tat mRNA. For RNA-RNA annealing, the locations of 11-nucleotide long regions that have the maximum rate factor coincide with experimentally determined nucleation sites. Dependence of the maximum rate factor on the length of antisense RNA is in agreement with observed relationship between hybridization rates and antisense lengths. Rate factors calculated for 32-sites in HIV-1 integrase mRNA also correlated with hybridization of antisense ODN to each site when measured by ODN-mediated, ribonuclease H-dependent cleavage of RNA. The model identified sites that hybridized readily over a range of magnesium ion concentration expected to affect RNA tertiary structure, suggesting that tertiary structure was either absent or was not an important impediment to hybridization. Calculated target site rate factors also corresponded to published data for antisense oligonucleotide hybridization with mRNAs of human genes encoding multidrug resistance, angiotensin type-1 receptor, c-myb, acetylcholinesterase, and hepatitis C virus. These results support the general applicability of the kinetic model and its potential utility for rapid identification of sites for antisense attack of mRNA.
La présente invention concerne l'hybridation d'acide nucléique dans des conditions stables par un modèle cinétique dans lequel on considère que l'état intermédiaire est localement monocaténaire. Une expression a été dérivée, et elle relie la structure secondaire d'acides nucléiques à la vitesse d'hybridation d'ARN d'oligonucléotide. Ce modèle considère que l'hybridation des acides nucléiques survient via un état intermédiaire dans lequel la région à hybrider possède une conformation monocaténaire avant la liaison de l'oligonucléotide antisens. Dans cette dérivation, un état stable est supposé. Ce modèle est applicable à un état stable dans des cellules vivantes et à l'étape initiale d'hybridation monotube lorsque l'hybride de pleine longueur n'a pas accumulé de façon importante et que la concentration de complexe de nucléation est approximativement constante. Ce modèle permet de calculer un facteur de vitesse qui est proportionnel à la constante de vitesse d'hybridation entre des acides nucléiques complémentaires. Lorsque des facteur de vitesse sont calculés à l'aide d'un algorithme disponible sur le marché de façon à estimer la structure secondaire d'ARN, ils donnent une bonne corrélation aux vitesses d'hybridation des oligonucléotides antisens (ODN) avec un ARN artificiel de nucléotide 101 qui a été publié et de balises moléculaires rattachées à l'ARNm tat du VIH-1. Pour la renaturation ARN-ARN, les localisations des régions longues de nucléotides 11 qui possèdent le facteur de vitesse maximum coïncident avec des sites de nucléation déterminés expérimentalement. La dépendance du facteur de vitesse maximum par rapport à la longueur de l'ARN antisens est en conformité avec la relation observée entre les vitesses d'hybridation et les longueurs d'antisens. Les facteurs de vitesse calculés pour 32 sites dans l'ARNm d'intégrase de VIH 1 sont également corrélés avec l'hybridation de l'ODN antisens à chaque site lorsqu'ils sont mesurés par clivage dépendant de la ribonucléase H induite par ODN. Ce modèle identifie des sites qui s'hybrident immédiatement sur une plage de concentration ionique de magnésium supposés affecter la structure tertiaire d'ARN, suggérant que cette structure tertiaire est soit absente, soit de peu d'importance dans l'hybridation. Les facteurs de vitesse de site cible calculés correspondent aussi aux données publiée de l'hybridation d'oligonucléotide antisens avec l'ARNm de gènes humains, codant pour la résistance à de multiples médicaments, le récepteur de type 1 d'angiotensine, c-myb, l'acétylcholinestérase et le virus de l'hépatite C. Ces résultats prennent en charge l'applicabilité générale du modèle cinétique et son utilité potentielle pour une identification rapide de sites d'attaque antisens d'ARNm.
Drlica Karl
Wang Jian-Ying
Mbm Intellectual Property Law Llp
The Public Health Research Institute Of The City Of New York Inc.
University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey
LandOfFree
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