C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 5/10 (2006.01) C12P 21/00 (2006.01)
Patent
CA 2577180
The present invention describes a single-protein production (SPP) system in living E. coli cells that exploits the unique properties of an mRNA interferase, for example, MazF, a bacterial toxin that is a single stranded RNA- and ACA-specific endoribonuclease, which efficiently and selectively degrades all cellular mRNAs in vivo, resulting in a precipitous drop in total protein synthesis. Concomitant expression of MazF and a target gene engineered to encode an ACA-less mRNA results in sustained and high-level (up to 90%) target expression in the virtual absence of background cellular protein synthesis. Remarkably, target synthesis continues for at least 4 days, indicating that cells retain transcriptional and translational competence despite their growth arrest. SPP technology works well for yeast and human proteins, even a bacterial integral membrane protein. This novel system enables unparalleled signal to noise ratios that should dramatically simplify structural and functional studies of previously intractable but biologically important proteins.
Système de production d'une seule protéine (SPP) dans des cellules vivantes E. coli tirant profit des propriétés uniques d'une interférase d'ARNm, notamment MazF, une toxine bactérienne qui est une endoribonucléase spécifique à l'ARN et à ACA à un seul brin, qui dégrade efficacement et sélectivement tous les ARNm cellulaires in vivo, avec pour effet d'entraîner une chute précipitée de la synthèse totale protéique. L'expression concomitante de MazF et un gène cible obtenu par ingénierie pour coder un ARNm sans ACA se traduit par un niveau élevé et soutenu, jusqu'à 90 %, de l'expression cible en l'absence virtuelle de la synthèse protéique cellulaire de fond. L'invention est remarquable en ce que la synthèse cible continue pendant au moins 4 jours, indiquant que les cellules retiennent la compétence transcriptionnelle et translationnelle malgré leur arrêt de croissance. La technologie SPP est efficace pour les protéines de levure et humaines, même pour une protéine de membrane intégrale bactérienne. Ce système innovateur permet d'obtenir des rapports signal-bruit non en parallèle qui devraient simplifier considérablement les études structurales et fonctionnelles de protéines réfractaires mais biologiquement importantes.
Masayori Inouye
Suzuki Motoo
Zhang Junjie
Dimock Stratton Llp
University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey
LandOfFree
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