Solid phase methods for polynucleotide production

Details Solid phase methods for polynucleotide production Solid phase methods for polynucleotide production

C - Chemistry, Metallurgy

07

H

C07H 21/00 (2006.01)

Patent

CA 2543014

Polynucleotides having in excess of 1,000 nucleotides can be prepared using a solid phase synthesis technique. A feature of the technique is the use of a reusable solid support that contains covalently bound oligonucleotide. This covalently bound oligonucleotide is annealed to a bridge oligonucleotide, where the bridge is also annealed to a first oligonucleotide that forms a portion of the target polynucleotide. After the target polynucleotide is synthesized, it can be removed from the solid support under denaturing conditions, and the solid support re-used to prepare additional target polynucleotides. The yield of the target polynucleotide increases when shearing force is applied to the solid support that is linked to the growing oligonucleotide. This shearing force is thought to extend the growing end of the oligonucleotide away from contact with other oligonucleotide bound to the solid support and make that end more accessible to annealing with solution oligonucleotide. The synthesis is conveniently accomplished on a porous frit, where reagents and washing solutions are pumped through the frit.

L'invention propose un procédé de synthèse en phase solide permettant la production de polynucléotides de plus de 1000 nucléotides. L'une des caractéristiques de ce procédé est l'utilisation d'un support solide réutilisable contenant l'oligonucléotide lié par covalence. Cet oligonucléotide subit une hybridation donnant un oligonucléotide pont dans lequel le pont est également hybridé donnant un premier oligonucléotide formant une partie du polynucléotide cible. Une fois que le polynucléotide cible est synthétisé, il peut être retiré du support solide dans des conditions de dénaturation, le support solide pouvant être réutilisé pour l'élaboration d'autres polynucléotides cibles. Le rendement du polynucléotide cible augmente lorsqu'on applique une force de cisaillement au support solide qui est lié à l'oligonucléotide mis en culture. On pense que la force de cisaillement tend, d'une part à provoquer une extension des extrémités de croissance de l'oligonucléotide en éloignement du contact avec un autre oligonucléotide lié au support solide, et d'autre part à rendre cette extrémité plus accessible au recuit avec l'oligonucléotide de la solution. Cette synthèse s'obtient facilement sur un disque en verre fritté poreux, les réactifs et les solutions de lavage étant pompées au travers du verre fritté.

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