Solid phase sequencing

Details Solid phase sequencing Solid phase sequencing

C - Chemistry, Metallurgy

12

Q

C12Q 1/68 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01)

Patent

CA 2513690

The present invention describes methods of sequencing a nucleic acid in a sample, based on the use of terminal-phosphate-labeled nucleotides as substrates for nucleic acid polymerases. The methods provided by this invention utilize a nucleoside polyphosphate, dideoxynucleoside polyphosphate, or deoxynucleoside polyphosphate analogue which has a colorimetric dye, chemiluminescent, or fluorescent moiety, a mass tag or an electrochemical tag attached to the terminal-phosphate. When a nucleic acid polymerase uses this analogue as a substrate, an enzyme-activatable label would be present on the inorganic polyphosphate by-product of phosphoryl transfer. Cleavage of the polyphosphate product of phosphoryl transfer viaphosphatase leads to a detectable change in the label attached thereon. In some instances the labeled polyphosphate may be detected directly via the label and provide information on the nucleic acid. When the polymerase assay is performed in the presence of a phosphatase, there is provided a convenient method for real-time monitoring of DNA or RNA synthesis and characterization of a target nucleic acid.

L'invention porte sur des procédés de séquençage d'un acide nucléique présent dans un échantillon utilisant comme substrat des polymérases d'acides nucléiques marqués par des phosphates terminaux. Lesdits procédés utilisent à cet effet un nucléoside polyphosphate, un didésoxynucléoside polyphosphate, ou un analogue de didésoxynucléoside polyphosphate comportant un fragment de colorant colorimétrique, chimioluminescent, ou fluorescent, un marqueur massif ou un marqueur électrochimique fixé à l'un des phosphates terminaux. Quand une polymérase d'acide nucléique utilise cet analogue comme substrat, un marqueur activable par des enzymes doit être présent sur le produit secondaire de polyphosphate minéral résultant du transfert du phosphoryle. Le clivage dudit polyphosphate par l'intermédiaire de la phosphatase induit une modification détectable du marqueur lui étant attaché. Dans certains cas, on peut détecter directement le polyphosphate par l'intermédiaire du marqueur et obtenir une information sur la nature de l'acide nucléique. Quant l'essai de la polymérase a lieu en présence d'une phosphatase, on dispose d'un moyen de suivi en temps réel de la synthèse de l'ADN et de l'ARN et de caractérisation d'un acide nucléique cible.

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