C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/86 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 15/867 (2006.01)
Patent
CA 2237000
The present invention relates to a stable, pseudotyped retrovirus packaging cell line comprising packaging cells which generate helper-free recombinant pseudotyped retrovirus. The packaging cell line comprises one or more non- retroviral expression constructs, such as an expression construct with the human cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter or derivatives of this promoter (e.g., pMD), which direct expression of: (a) retroviral gagpol genes and (b) a non-retroviral gene which is under the control of an inducible operator system and whose gene product pseudotypes retroviral core virions. The present invention further relates to a method of making a stable, pseudotyped retrovirus packaging cell line which generates helper-free recombinant pseudotyped retrovirus. The present invention further relates to the particular packaging cell lines described herein (i.e., H29 gagpol, H29 new gagpol) and the particular cells and constructs (i.e., packaging elements) used to produce the stable, pseudotyped retrovirus packaging cell line described herein (e.g., H29 cells and pMD, pMDtet, pMDtet.G, PMD.gagpol, pMD.new gagpol constructs). The present invention relates to a retroviral vector for producing a cDNA library for expression in mammalian cells, comprising two retroviral long terminal repeats, a cloning site for insertion of cDNA and a cytomegalovirus promoter. The invention also relates to a cDNA library for expression in mammalian cells, the library comprising retroviral vectors of the present invention. The present invention also relates to a method of expression cloning in mammalian cells. The present invention also relates to a method of cDNA expression cloning in mammalian cells. The present invention also relates to a method of identifying a gene defect responsible for a mutant phenotype using cDNA expression cloning by complementation in mammalian cells.
La présente invention se rapporte à une lignée cellulaire stable d'encapsidation de rétrovirus pseudotypé, cette lignée cellulaire comprenant des cellules d'encapsidation qui génèrent un rétrovirus pseudotypé de recombinaison sans auxiliaire. La lignée cellulaire d'encapsidation comprend une ou plusieurs constructions d'expression non rétrovirales tel qu'une construction d'expression dont le cytomégalovirus humain (CMV) est proche du promoteur précoce ou de dérivés de ce promoteur (tel que pMD) qui dirigent l'expression: a) de gènes gagpol rétroviraux et b) d'un gène non rétroviral qui est sous le contrôle d'un système opérateur inductible dont le produit génique génère des pseudotypes de virions coeur rétroviraux. La présente invention se rapporte également à un procédé de production d'une lignée cellulaire stable d'encapsidation de rétrovirus pseudotypé qui génère un rétrovirus pseudotypé de recombinaison sans auxiliaire, ainsi qu'à des lignées celluaire d'encapsidation spécifiques décrites dans cette demande (telle que H29 gagpol, un nouveau H29 gagpol) et à des cellules et des constructions spécifiques (tels que des éléments d'encapsidation) utilisés pour produire la lignée cellulaire stable d'encapsidation de rétrovirus pseudotypé décrite dans cette demande (telles que des cellules H29 et des constructions pMD, pMDtet, pMDtet.G, PMD.gagpol, p.MD nouveau gagpol). La présente invention se rapporte en outre à un vecteur rétroviral destiné à produire une banque d'ADNc pour l'expression dans des cellules mammaliennes, et comprenant deux longs segments terminaux à répétitions rétroviraux, un site de clonage pour l'insertion de l'ADNc et un promoteur de cytomégalovirus. L'invention se rapporte à une banque d'ADNc pour l'expression des cellules mammaliennes, cette banque comprenant les vecteurs rétroviraux, ainsi qu'à un procédé de clonage d'expression dans des cellules mammaliennes; à un procédé de clonage d'expression de l'ADNc dans les cellules mammaliennes, et à un procédé d'identification d'un défaut génique responsable d'un phénotype mutant mettant en oeuvre le clonage d'expression de l'ADNc par complémentation dans les cellules mammaliennes.
Mulligan Richard C.
Ory Daniel S.
Sadelain Michel
Schaffer Jean E.
Ogilvy Renault Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
The Whitehead Institute For Biomedical Research
Washington University
LandOfFree
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