C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/44 (2006.01) G01N 33/535 (2006.01)
Patent
CA 2277430
A CHO-K1 cell line stably expressing a recombinant full-length human PDE IVa (rhPDEIVa) enzyme was established under hygromycin B selection. Inhibition of the expressed PDE IVa activity by selective PDE IV inhibitors was evaluated. The rank order of potencies of the inhibitors in elevating cAMP in the whole- cell assay was quite different from that on the soluble enzyme. The whole-cell rank order of potencies was also maintained when PKA activity ratios were measured in place of cAMP levels. When inhibition of soluble PDE IVa activity was examined in the presence of 100 mM MgCl2, the rank order of potencies of the inhibitors mirrored that obtained for the whole-cell assays (both cAMP and PKA). The observed "high-affinity" conformation of the enzyme was not dependent upon a specific cation or anion. The shift in sensitivity of the rhPDE IVa enzyme for (R)-rolipram in the presence of increased ionic strength was accompanied by an enhanced capacity of the soluble enzyme preparation to specifically bind [3H](R)-rolipram with high-affinity.
On a déterminé une lignée cellulaire CHO-K1 exprimant de façon stable une enzyme humaine PDE IVa de recombinaison à longueur totale (rhPDEIVa) par sélection d'hygromycine B. On a évalué l'inhibition de l'activité de PDE IVa exprimée par des inhibiteurs sélectifs de PDE IV. L'ordre de classification des puissances des inhibiteurs en élevant cAMP dans la méthode de détermination de cellules entières s'est avéré totalement différent de celui obtenu avec l'enzyme soluble. L'ordre de classification des puissances s'est également maintenu quand on a mesuré des rapports d'activité de PKA à la place de niveaux de cAMP. Quand on a examiné l'inhibition de l'activité de PDE IVa soluble en présence de 100 mM de MgCl¿2?, l'ordre de classification des puissances des inhibiteurs s'est avéré être identique à celui qu'on avait obtenu pour les méthodes de détermination de cellules entières (à la fois cAMP et PLA). La conformation observée d'affinité élevée de l'enzyme ne dépendait pas d'un cation ou d'un anion spécifique. Le déplacement de sensibilité de l'enzyme rhPDE IVa pour (R)-rolipram en présence d'une force ionique accrue était accompagné par une capacité améliorée de la préparation d'enzyme soluble à se fixer de façon spécifique et avec une affinité élevée à [3H](R)-rolipram.
Merck Frosst Canada & Co.
Ogilvy Renault
LandOfFree
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