C - Chemistry – Metallurgy – 40 – B
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
40
B
C40B 50/06 (2006.01) C12N 15/00 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C40B 40/06 (2006.01)
Patent
CA 2693102
The present invention provides a novel method of producing a plurality of modified polynucleotides having different combinations of various mutations at multiple sites by a tailored multi-site combinatorial assembly, comprising adding at least two or at least three primers to a double stranded template polynucleotide in a single reaction mixture, wherein the primers are not overlapping, and wherein each of the primers comprise at least one mutation different from the other primers, wherein at least one primer is a forward primer that can anneal to a minus strand of the template and at least one primer is a reverse primer that can anneal to a plus strand of the template, and subjecting the reaction mixture to a polymerase extension reaction to yield a plurality of extended modified polynucleotides from the at least three primers. The method can be performed without employing a ligation step prior to transforming the extended modified polynucleotides into a cell. The plurality of extended modified polynucleotides can be treated with an enzyme for destroying the template polynucleotide prior to transforming in to the cell.
La présente invention concerne un procédé inédit de production d'une pluralité de polynucléotides modifiés comportant des combinaisons différentes de mutations diverses au niveau de sites multiples par assemblage combinatoire multi-sites sur mesure, comprenant l'addition d'au moins deux ou d'au moins trois amorces à une matrice polynucléotidique double-brin dans un mélange réactionnel unique, les amorces ne se chevauchant pas et chacune des amorces comprenant au moins une mutation différente de celles des autres amorces, au moins une amorce étant une amorce sens pouvant s'anneler avec un brin négatif de la matrice et au moins une amorce étant une amorce antisens pouvant s'anneler avec un brin positif de la matrice. Le mélange réactionnel est ensuite soumis à une réaction d'extension utilisant la polymérase afin de donner une pluralité de polynucléotides étendus modifiés à partir des au moins trois amorces. Ce procédé peut être mis en uvre sans avoir recours à une étape de ligature préalablement à la transformation des polynucléotides étendus modifiés dans une cellule. La pluralité de polynucléotides étendus modifiés peut être traitée au moyen d'une enzyme en vue de détruire la matrice polynucléotidique préalablement à la transformation dans la cellule.
Bp Corporation North America Inc.
Norton Rose Or S.e.n.c.r.l. S.r.l./llp
Verenium Corporation
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1665587